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Jun 08, 2023

Conocimientos metagenómicos sobre las comunidades microbianas hipóxicas y de nutrientes en la interfaz de macroincrustaciones/acero que conducen a una CIM grave

Degradación de materiales npj

npj Materials Degradation volumen 7, Número de artículo: 41 (2023) Citar este artículo

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La macroincrustación adherente en ambientes marinos provocó una corrosión compleja de las superficies de acero, lo que resultó en una corrosión localizada en la interfaz ostra/acero y una corrosión uniforme en la interfaz ascidia/acero. Las bacterias reductoras de sulfato (SRB) se han implicado en el proceso de corrosión influenciado microbiológicamente (MIC) en las interfaces cubiertas por macroincrustaciones. Para comprender mejor el papel de los biofilms marinos como mediadores clave en el proceso MIC, se utilizaron técnicas metagenómicas para estudiar las comunidades microbianas y su respuesta a la cobertura de macroincrustaciones. En comparación con las ascidias, la zona anaeróbica local formada en la interfaz ostra/acero estimuló el crecimiento de las SRB, lo que llevó a un mayor contenido de FeS y una corrosión localizada grave. Se encontró que SRB Desulfovibrio y Desulfobulbus, junto con el gen funcional dsr relacionado con SRB, aumentaron, mientras que los genes de función relacionados con el oxígeno coxC, ccoN, ccoO, ccoP y ccoQ disminuyeron. Por el contrario, las superficies de acero sin cobertura de macroincrustaciones tenían las comunidades microbianas más ricas, pero experimentaron una CIM menos severa, lo que sugiere que no hay una conexión directa entre la abundancia/diversidad microbiana y la promoción de la corrosión del acero.

Los organismos incrustantes marinos se refieren al término general para animales, plantas y microorganismos adheridos a la superficie de las instalaciones marinas. Según el tamaño del cuerpo, se clasifican en organismos microincrustantes (escala micrométrica) y organismos macroincrustantes (escala centimétrica)1,2,3. Los organismos incrustantes pueden afectar negativamente a las infraestructuras marinas, como barcos, puentes, plataformas petrolíferas y oleoductos3,4,5,6. Actualmente, hay dos direcciones de investigación principales con respecto a la relación entre la bioincrustación y la corrosión marina de metales.

En primer lugar, estudiar el efecto de los microorganismos sobre la corrosión marina de metales. Se cree que los microorganismos contribuyen significativamente al proceso de oxidación de los metales. Los microorganismos formadores de biopelículas pueden colonizar rápidamente las superficies metálicas para formar una estructura tridimensional (3D) dinámica y altamente compleja que puede acelerar o inhibir la MIC7,8. Actualmente, la investigación sobre microorganismos corrosivos marinos se centra principalmente en bacterias cultivables en el laboratorio para estudiar los efectos de colonias mixtas o individuales sobre la corrosión de metales en entornos de campo simulados o condiciones experimentales controladas9,10,11. Un número considerable de artículos han investigado los efectos de las bacterias reductoras de sulfato (SRB)12,13,14,15, las bacterias reductoras de nitrato (NRB)16,17,18, las bacterias productoras de ácido (APB)19 y las bacterias del hierro. (IB)20,21 sobre la corrosión de metales en el medio marino. En condiciones anóxicas, los SRB se consideran comúnmente los principales culpables de MIC14, que puede usar sulfato como aceptor terminal de electrones para degradar compuestos orgánicos, lo que lleva a la producción de sulfuros corrosivos12,13,14,15. Gu et al.22,23 clasificaron los ataques de MIC anaeróbicos en dos tipos diferentes: MIC de transferencia de electrones extracelulares (EET-MIC) causados ​​por la respiración de los microbios, y MIC de metabolitos (M-MIC) causados ​​por la secreción de metabolitos corrosivos. Recientemente, la investigación sobre el mecanismo de MIC se ha profundizado cada vez más. Zhou et al.24 descubrieron que Shewanella oneidensis MR-1, un microbio modelo atractivo, puede consumir directamente electrones de metales que contienen hierro en condiciones aeróbicas. Los hallazgos demuestran que la corrosión puede ocurrir a través de una vía significativa de transferencia directa de electrones entre el metal y el microbio. La corrosión anaeróbica a través de flavinas o H2 como transportadores de electrones, así como la captación directa de electrones de Fe0, se han propuesto como posibles mecanismos de corrosión por parte de S. oneidensis y especies relacionadas25,26,27,28. Tang et al.28 encontraron que la corrosión del acero inoxidable se produce a través de la transferencia directa de electrones de hierro a microbios por Geobacter sulfurreducens y Geobacter metallireducens, que son electrótrofos que se sabe que aceptan directamente electrones de otros microbios o electrodos. Se ha confirmado que otra bacteria electroactiva marina representativa, Pseudomonas aeruginosa, una bacteria omnipresente competente para desarrollar biopelículas en hábitats marinos, causa una CIM grave en el acero al carbono a través de la transferencia de electrones extracelulares (EET)29,30,31. Zhou et al.31 encontraron que la biocorrosión del acero inoxidable en el agua marina se aceleró a través del gen phzH que codifica la transferencia extracelular de electrones de Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, dado que hay 105 a 106 especies de microorganismos en el medio ambiente, el estudio de un solo microorganismo es limitante. Por lo tanto, el análisis de las comunidades microbianas en el ambiente marino corrosivo también hace una contribución significativa a la investigación sobre la CIM marina32,33. La tecnología de secuenciación de alto rendimiento proporciona una buena idea. La secuenciación de alto rendimiento, que difiere de la secuenciación tradicional de Sanger (didesoxi), es una técnica que puede secuenciar en paralelo una gran cantidad de moléculas de ácido nucleico a la vez34,35,36,37,38. Por lo general, una sola reacción de secuenciación puede producir datos de secuenciación de no menos de 100 Mb. Procopio et al.38 propusieron que, cuando se combinan con datos de secuenciación de muestras ambientales, metodologías como la metagenómica, el metatranscriptoma y la metabolómica abrirán otros horizontes en la comprensión del papel de las biopelículas microbianas corrosivas. La aparición de técnicas de secuenciación de ADN de alto rendimiento ha facilitado la identificación de especies microbianas que están implicadas en los procesos de corrosión de las aleaciones, tanto directa como indirectamente38. Huttunen-Saarivirta et al.35 revelaron diferencias entre los grados de acero inoxidable en el comportamiento de la corrosión y la tendencia a la bioincrustación en agua de mar salobre utilizando secuenciación de alto rendimiento (secuenciación HTP). Zhang et al.32 utilizaron secuenciación de alto rendimiento para investigar la comunidad microbiana en la capa de óxido de la superficie metálica después de 30 meses de inmersión en agua de mar. Propusieron que cada aleación de metal, incluido el acero al carbono, la aleación de cobre y la aleación de aluminio, conduciría al desarrollo de una comunidad microbiana distinta. Además, se formaron diferentes comunidades microbianas relacionadas con la corrosión en las capas de óxido interior, media y exterior del acero al carbono.

En segundo lugar, estudie el efecto de los organismos macroincrustantes marinos sobre la corrosión de los metales. La macroincrustación se puede categorizar como incrustación blanda (algas no calcáreas, esponjas y ascidias, et al.) y incrustación dura (percebes, ostras, et al.), en función de la presencia o ausencia de conchas calcáreas3,39. Se ha observado que la fijación de macroincrustaciones puede dañar significativamente la integridad y el rendimiento de las estructuras marinas6,40,41. Por ejemplo, la macroincrustación de conchas calcáreas, como ostras y percebes, puede provocar una corrosión localizada grave de las instalaciones marinas40. La explicación más común para este fenómeno es que la adhesión del macrofouling crea una "capa de confinamiento biológico" en la superficie del acero. El interior de la capa se convierte en un ambiente deficiente en oxígeno, mientras que hay suficiente oxígeno fuera de la capa. La formación de celdas de concentración de oxígeno acelera la corrosión por grietas en la interfaz entre la macroincrustación y el acero3.

Sin embargo, la interfaz entre el macrofouling y el acero forma un ecosistema independiente. Los principales componentes de las secreciones de macroincrustaciones son proteínas y polisacáridos, que crean un ambiente eutrófico que promueve el crecimiento microbiano42,43,44,45. Perme et al.46 encontraron que la corrosión severa localizada de pilotes de puentes de acero bajo el agua en Florida estaba relacionada con la corrosión influenciada por microincrustaciones y microorganismos. También encontraron que las grietas formadas por contaminantes macroincrustantes tienen un impacto significativo en el crecimiento de SRB y el desarrollo de MIC. El proceso MIC dominado por SRB se desarrolla rápidamente en ambientes cerrados ocupados por organismos macroincrustantes5. Por lo tanto, para estudiar la corrosión afectada por la cobertura de macrofouling, es necesario establecer el mecanismo de corrosión del acero bajo el efecto sinérgico de la comunidad microbiana y el macrofouling, examinando el comportamiento de corrosión en la interfase y la abundancia y diversidad de microorganismos.

En este estudio, investigamos el comportamiento frente a la corrosión de superficies de acero de baja aleación y alta resistencia cubiertas por ostras (representantes de organismos de incrustaciones duras) y ascidias (representantes de organismos de incrustaciones blandas) mediante experimentos de inmersión de campo y caracterización de laboratorio. Utilizamos tecnología de secuenciación de alto rendimiento para estudiar las características de la comunidad microbiana de la capa de óxido en la interfaz macroincrustante/acero, según los tipos de corrosión y la composición de la capa de óxido. Además, examinamos las comunidades microbianas en las secreciones y tejidos de ostras debido a su papel en la corrosión localizada. Nuestros resultados mostraron que el microambiente heterogéneo aeróbico/anaeróbico formado en la interfaz y la fuente de nutrientes proporcionada por las secreciones de macroincrustaciones conducen al crecimiento de bacterias anaeróbicas y aceleran la corrosión del acero. Este estudio proporciona información sobre el efecto sinérgico de la macroincrustación y los microorganismos en la corrosión del acero y contribuye al estudio de la estrecha relación entre el crecimiento microbiano y la macroincrustación.

Los organismos de incrustaciones blandas y duras podrían representar amenazas potenciales para las instalaciones marinas. Las ostras, como representantes de los organismos de incrustaciones duras, se componen de un cuerpo blando protegido por dos secciones de concha complejas. La concha de la ostra está hecha principalmente de carbonato de calcio al 97 %, lo que le proporciona una resistencia a la flexión significativa y una baja conductividad. Las ascidias, por otro lado, son representantes de organismos de incrustaciones blandas. Son altamente adaptables al medio ambiente y tienen una fuerte competitividad espacial, lo que les permite ocupar rápidamente superficies de acero y alterar la diversidad y características estructurales de la comunidad bentónica original.

Para investigar el comportamiento frente a la corrosión del acero cubierto por incrustaciones blandas y duras, las muestras de acero se sumergieron en agua de mar durante 9 meses. Luego, la macroincrustación cubierta se eliminó después de recolectar las muestras de acero contaminadas. Se observaron diferentes tipos de corrosión entre las interfases cubiertas de ostras y ascidias (Fig. 1). Se observó corrosión localizada severa en áreas donde las ostras no podían cubrirse completamente debido a la forma irregular de sus conchas, mientras que se observó corrosión uniforme en la superficie de acero sucia cubierta por ascidias.

Análisis de morfología macroscópica de la superficie de acero para especímenes OY, AS y SW después de nueve meses de inmersión. Las imágenes SEM correspondieron a la morfología del óxido interfacial después de eliminar la macroincrustación, y la espectroscopia confocal láser correspondió a la morfología de la superficie de acero desnudo después de eliminar la macroincrustación y el óxido. OY, la superficie de acero cubierta por ostras; AS, la superficie de acero cubierta por ascidias; SW, la superficie de acero que no está cubierta por macrofouling.

La evidencia se obtuvo mediante las imágenes SEM y la correspondiente espectroscopia confocal láser (fig. 1). Al retirar la macroincrustación, se observó en las imágenes SEM que para la muestra de acero cubierta por ostra (OY), se produjo una gran área de descamación en la capa exterior de óxido y se generaron daños locales con picaduras de corrosión irregulares en esta área. Para muestras de acero cubiertas por ascidias (AS), la capa de óxido también era densa, pero apareció una estructura floculante en la capa superior del óxido. Para muestras de acero que no estaban cubiertas por macroincrustaciones (SW), la capa exterior de óxido estaba suelta y se caía fácilmente, la morfología típica del acero sumergido en agua de mar después de una inmersión a largo plazo47. No fue difícil encontrar que la secreción de la macroincrustación penetró en la capa de óxido y cambió la estructura de la capa de óxido, la cobertura de la macroincrustación cambió el estado de la capa exterior de óxido.

Consistentemente, los resultados CLSM mostraron que después de remover la capa de óxido, el espécimen OY tenía una superficie de acero significativamente destruida, con daño local significativo y brechas de corrosión, mientras que el espécimen AS tenía una superficie de acero relativamente uniforme sin daño local obvio. Se extrajeron las diferencias máximas en los valores de profundidad de corrosión, y el valor máximo de profundidad de corrosión para la muestra OY fue de 721,0 μm, mucho mayor que los valores de las muestras AS (453,048 μm) y SW (521,1 μm). También se analizaron los valores medios de rugosidad, siendo los valores medios Sa de la superficie de acero desnudo ordenados de mayor a menor: OY > AS > SW. Se creía que la cobertura de macrofouling afectaba la rugosidad de la superficie del acero y promovía el inicio de picaduras por corrosión. Sin embargo, la brecha formada por el entorno de cobertura de la concha calcárea de la ostra desarrolló aún más estas picaduras de corrosión, lo que provocó daños y corrosión localizados graves. En contraste, las picaduras de corrosión promovidas por la cobertura de ascidias parecían estar conectadas en láminas, mostrando una corrosión uniforme.

Los productos de corrosión juegan un papel importante en la explicación de la evolución de la corrosión. XPS se utilizó para detectar el constituyente elemental de la capa de óxido formada en la interfaz macroincrustante/acero (Fig. 2). El escaneo de inspección XPS de los productos de corrosión reveló que los elementos principales eran Fe, C, O y S. Los espectros de alta resolución de Fe 2p (Fig. 2a) de las tres muestras se descompusieron en picos en 720.148, 711.849, 725.349, 50, 710,751 y 723,552 eV, relacionados con Fe0, FeOOH 2p3/2, FeOOH 2p1/2, Fe3O4 2p3/2 y Fe3O4 2p3/2, respectivamente. Mientras que se encontró un pico de 713,6 eV (FeS 2p3/2)50 en muestras OY-RU y AS-RU, lo que indica que se produjo FeS en la interfaz de macroincrustaciones/acero. Esta conclusión también podría confirmarse mediante espectros de alta resolución S 2p (Fig. 2d). Los espectros de S 2p registrados de los tres especímenes estaban compuestos por un pico común a 169,6 eV53 correspondiente a SO42- de GR(SO42-). Mientras que los productos de corrosión de las muestras OY-RU y AS-RU se descompusieron en picos de 161,0 (S2− 2p3/2) y 163,0 eV (S2− 2p1/2)54, relacionados con FeS. Los espectros de alta resolución de O 1s (Fig. 2c) se descompusieron en picos a 530,0 y 531,6 eV, relacionados con OH− y O2−, respectivamente55. Los espectros de alta resolución de C 1s (Fig. 2e) revelaron tres picos: grupos carboxilato (O=C–O) a 289,1 eV, enlace C–C a 284,6 eV y enlace C–O a 286,1 eV. El C-C puede resultar del carbono alifático, y el C-C puede resultar del carbono unido al oxígeno de los polisacáridos o péptidos/proteínas56,57. Los grupos carboxilato (O=C–O) pueden provenir de EPS, fue evidencia de la acumulación de ácidos orgánicos, los metabolitos bacterianos comunes atrapados dentro de la biopelícula58. El EPS y FeS generados indicaron que las bacterias reductoras de sulfato pueden estar involucradas en el proceso MIC en la interfaz de macroincrustaciones/acero.

Espectros XPS de la capa de óxido formada en la interfase macrofouling/acero después de nueve meses de inmersión. a Exploración de exploración, espectros de alta resolución b Fe 2p, espectros de alta resolución c O 1s, espectros de alta resolución d S 2p y espectros de alta resolución e C 1s de las muestras OY-RU, AS-RU y SW- RU. OY-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfase ostra/acero; AS-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfase ascidia/acero; SW-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfaz de acero que no está cubierta por macroincrustaciones.

Para explorar más a fondo, se produjo FeS en la interfaz macrofouling/acero, se caracterizó la capa de óxido utilizando un espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier (FT-IR), y se examinó el espectro resultante en busca de modos de vibración característicos correspondientes a diferentes productos de corrosión (Fig. 3a). Los resultados confirmaron la presencia de magnetita Fe3O4, GR(SO42−), lepidocrocita γ-FeOOH, akageneita β-FeOOH, goethita α-FeOOH y mackinawita FeS. El pico a 1020 cm−1 se identificó como el modo de vibración Fe-O de γ-FeOOH3,59,60,61, se encontró que los picos a 795 y 885 cm−1 eran de α-FeOOH3,59,60,61 , mientras que los picos a 420, 665 y 840 cm−1 se asignaron a β-FeOOH3,47,61,62,63. Los picos de enlace Fe-O típicos de Fe3O4 se observaron a 463 y 570 cm−1 3,61,64. Además, los picos a 1021 y 1117 cm−1 se asignaron a FeS3,61,65,66, mientras que los picos a 660 cm−1 se atribuyeron a GR(SO42−)3,61,67,68. Las bandas espectrales en el rango de 1400–1450 cm−1 correspondieron al estiramiento simétrico de C=O y la deformación de O–H en COOH a partir de proteínas y polisacáridos, que se han informado previamente como los principales constituyentes de biopelículas involucradas en MIC65, 69. La presencia de FeS y biopelículas respalda aún más el crecimiento de SRB en la interfaz moacrofouling/acero.

a Espectros FT-IR y b Espectros XRD de la capa de óxido formada en la interfase macrofouling/acero después de nueve meses de inmersión. OY-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfase ostra/acero; AS-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfase ascidia/acero; SW-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfaz de acero que no está cubierta por macroincrustaciones.

También se realizó un análisis de espectro XRD en la capa de óxido (Fig. 3b). Los resultados también mostraron que Fe3O4 (archivo ICCD 76-0958), GR(SO42−) (archivo ICCD 13-0092), γ-FeOOH (archivo ICCD 74-1877), α-FeOOH (archivo ICCD 08-0098) y β-FeOOH (archivo ICCD 08-0098) fueron los principales productos de corrosión en el entorno de inmersión en agua de mar70,71. Sin embargo, en la interfaz cubierta por macroincrustaciones, el crecimiento de SRB condujo a la formación de FeS (archivo ICCD 37-0477).

Se realizó la secuenciación de amplicones para comprender las diferencias y la dinámica de las comunidades microbianas a lo largo del tiempo en el óxido y las biopelículas en las superficies de acero. Con la plataforma de secuenciación Illumina NovaSeq, obtuvimos un total de 911 800 etiquetas efectivas y 19 201 unidades taxonómicas operativas (OUT, 97 % de similitud) de especímenes AS-RU, OY-RU, OYS, OYT y SW-RU (Tabla complementaria 1) , detectándose un total de 934 géneros. Después de analizar los 19.201 OUT y tomar el promedio de especímenes paralelos, se obtuvo la figura de la flor y el diagrama de Venn (Fig. 4), que mostró que hubo 159 OUT compartidos por los cinco especímenes. Las SALIDAS de SW-RU fueron las más altas, con valor de 4816. Seguidas de OY-RU y AS-RU, con valores de 1410 y 814, respectivamente. Significaba que el entorno oxidado era favorable para el crecimiento microbiano, lo que corresponde a la mayor abundancia de comunidades microbianas. En contraste, la abundancia de comunidades microbianas de secreciones de ostras fue la más baja.

a Figura de flor y b Diagrama de Venn. OY-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfase ostra/acero; AS-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfase ascidia/acero; SW-RU, la capa de óxido o biopelícula en la interfaz de acero que no está cubierta por macroincrustaciones; OYS, la biopelícula en la secreción de la ostra; OYT, la biopelícula en el tejido de la ostra.

Se analizó la diversidad α de las muestras AS-RU, OY-RU, OYS, OYT y SW-RU para mostrar la diversidad de la comunidad microbiana.

Se obtuvo el índice de abundancia y diversidad de las comunidades microbianas en biopelículas y cada entorno (Fig. 5a y Tabla complementaria 1). Los valores de Chao1, Ace, índices de Shannon, índices y OTU ordenados de mayor a menor fueron: SW-RU > OY-RU > AS-RU > OYT > OYS. Estos índices reflejaron información sobre la abundancia y diversidad de la comunidad, lo que indica que las comunidades microbianas en la superficie de acero sin cobertura de macroincrustaciones tenían la mayor abundancia y diversidad entre los tres especímenes de capa de óxido (SW-RU, OY-RU y AS-RU). La cobertura de macrofouling condujo indirectamente a una disminución en la abundancia y diversidad de las comunidades microbianas en la capa de óxido. Al comparar los estados de corrosión interfacial de los tres especímenes (Fig. 1), se creía que solo unos pocos microorganismos corrosivos desempeñaban un papel clave en el proceso MIC. En particular, el espécimen OYS tuvo la menor abundancia y diversidad de la comunidad microbiana de los tres especímenes asociados con las ostras (OY-RU, OYS y OYT). La Figura 5b mostró los valores p para los índices de Shannon y Chao1 obtenidos mediante el análisis de varianza seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas (valores de p < 0,05), lo que indica que las comunidades microbianas en las muestras de roya (SW-RU, AS-RU y OY-RU) eran más complejas. A medida que la capa de óxido estaba cubierta por macroincrustaciones, la comunidad microbiana en la capa de óxido cambió diferencialmente con el gradiente de concentración de oxígeno, y tales diferencias en la diversidad microbiana reflejaron el ecosistema en la interfaz cubierta.

Estimadores de diversidad alfa de comunidades microbianas en cada ambiente. a Los índices de Chao1, los índices de ACE, los índices de Shannon y los diagramas de caja de OTU observados de los estimadores de diversidad α para los grupos AS-RU, OY-RU, OYS, OYT y SW-RU. La línea en el medio del cuadro, la parte superior e inferior del cuadro y los bigotes representan la mediana, los percentiles 25 y 75 y los valores mínimo a máximo, respectivamente. Las barras de error representan las desviaciones estándar de muestras por triplicado. b Valores de p para los índices de Shannon y Chao1 obtenidos mediante análisis de varianza seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey-Kramer. Los fondos rojos representan pares con valores p < 0,05.

Además, la curva de rarefacción y la curva de abundancia de rango de los genes 16S rRNA también podrían usarse para describir la diversidad de especímenes (Fig. 1 complementaria). Para la curva de rarefacción, una curva de aplanamiento significa que la cantidad de datos de secuenciación es gradualmente razonable, es decir, solo se generará una pequeña cantidad de especies nuevas incluso con más datos. La abundancia de rango refleja intuitivamente la riqueza y la uniformidad de las especies en el espécimen. En la dirección horizontal, cuanto mayor es la riqueza de especies, mayor es el tramo de la curva en el eje x; en la dirección vertical, cuanto más suave sea la curva, más uniforme será la distribución de las especies. Como se puede ver en la curva de rarefacción (Fig. 1a complementaria), el Número de SALIDA de la curva de rarefacción ordenado de mayor a menor fue: SW-RU> OY-RU> AS-RU> OYT> OYS, mostrando la misma tendencia que Fig. 5 y Tabla complementaria 1. Pero la curva para la muestra SW-RU no fue estable con más número de secuencia, lo que sugirió que la diversidad de bacterias de la muestra SW-RU fue mucho mayor de lo esperado. Aunque los especímenes SW-RU tenían la mayor abundancia y diversidad microbiana, la uniformidad de su especie fue menor que la de los especímenes AS-RU y OY-RU, como se muestra en la curva de rango de abundancia (Fig. 1b complementaria). La distribución de especies más desigual de los especímenes OY-RU también reflejó que el entorno especial cubierto por la capa calcárea daría lugar a grandes diferencias en las comunidades microbianas.

Se analizó la diversidad β de los especímenes AS-RU, OY-RU, OYS, OYT y SW-RU para comparar y analizar la composición de la comunidad microbiana entre diferentes especímenes.

El resultado del análisis de escala multidimensional no métrica (NMDS) basado en el nivel de OTU se utilizó para reflejar el grado de diferencia entre las muestras AS-RU, OY-RU, OYS, OYT y SW-RU a través de la distancia entre puntos (Fig. 6a), que puede reflejar mejor la estructura no lineal de los datos ecológicos72. A partir de los resultados del NMDS, se pudo ver que las muestras OYT y OYS tenían similitudes obvias, mientras que las muestras OY-RU y AS-RU tenían similitudes obvias. El espécimen SW-RU tenía una larga distancia, lo que demostró además que la cobertura de macroincrustaciones condujo al cambio de las comunidades microbianas en la capa de óxido.

a Diagrama de escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) de distancias Bray-Curtis y b Árbol de conglomerados UPGMA basado en distancia Unifrac y distancia Unifrac no ponderada entre especímenes AS-RU, OY-RU, OYS, OYT y SW-RU basado en OTU para bacterias 1, 2 y 3 representan los tres especímenes paralelos muestreados en diferentes sitios a lo largo de la interfaz de AS-RU, OY-RU y SW-RU.

El árbol de clústeres UPGMA, que se basó en la distancia Unifrac y la distancia Unifrac no ponderada, mostró los mismos resultados (Fig. 6b). El espécimen SW-RU contenía otras comunidades microbianas que compartían con los otros cuatro especímenes, lo que significaba que el entorno especial de la superficie de contacto macroincrustante/cubierta de acero conducía a la existencia de comunidades microbianas características, y las secreciones de macroincrustantes también compartían una parte de las comunidades microbianas para en cierta medida. Además, como las transiciones en las muestras cubiertas con macroincrustaciones (OY-RU y AS-RU) eran mayores que las de las muestras no cubiertas (SW-RU), hubo una correlación entre los cambios en la comunidad microbiana y la progresión de la corrosión. .

La abundancia relativa de las secuencias del gen 16S rRNA de los especímenes OYT, OYS, OY-RU, AS-RU y SW-RU a nivel de phylum (Fig. 7a), nivel de clase (Fig. 7b) y nivel de género (Fig. 7c) (abundancia relativa > 1%) para analizar la composición de la comunidad microbiana. Se detectaron un total de 82 filos, 171 clases y 934 géneros.

Composición taxonómica de la comunidad microbiana. Análisis de composición a nivel de filo, nivel de clase b y nivel de género c de las principales secuencias del gen 16S rRNA bacteriano (abundancia relativa> 1%) obtenidas de muestras OYT, OYS, OY-RU, AS-RU y SW-RU. d El cladograma de taxones discriminatorios identificados en los grupos relacionados con la roya (OY-RU, AS-RU y SW-RU) por análisis LEfSe (Análisis Discriminante Lineal (LDA), log score >3.5, P = 0.05). La abundancia relativa de cada taxonomía fue el valor promedio de eso por triplicado.

Los principales filos de comunidades microbianas observados en las cinco muestras fueron Proteobacteria (38,6–96,7 %), Firmicutes (1,5–96,7 %), Cianobacteria (−10,2 %), Bacteroidota (−10,2 %), Campylobacterota (−5,3 %), Desulfobacterota (−5,3 %), Actinobacteriota (−2,7 %), Actinobacteria (−3,0 %), Verrucomicrobiota (−1,6 %) y sus abundancias relativas varían de una muestra a otra (Fig. 7a), p. ej., se detectaron conjuntamente Proteobacteria y Firmicutes de todos los ejemplares, Bacteroidetes compartido por los ejemplares OYT, OY-RU, AS-RU y AS-RU. Excepto por estos tres filos, la capa de óxido en la interfase macrofouling/acero tenía una distribución comunitaria más rica, que Campylobacterota, Actinobacteria y Verrucomicrobiota compartían con los especímenes OY-RU y AS-RU. En particular, OY-RU tenía phylum Desulfobacterota y Actinobacteria, el ambiente de cobertura por la concha calcárea de las ostras resultó en una disminución en la abundancia relativa de Proteobacteria y Bacteroidota en la capa de óxido, fueron reemplazadas por Desulfobacterota. Tales diferencias pueden estar influenciadas por la concentración de oxígeno y los estados de secreciones. Como casi todas las especies de Desulfobacterota son SRB73,74, lo que demuestra que el ambiente en la interfaz ostra/acero era anaeróbico. Se ha demostrado que Desulfobacterota es la principal bacteria que acelera la corrosión localizada, lo que explica bien el FeS generado en la interfaz ostra/acero, y se cree que Desulfobacterota está involucrada en la formación de picaduras de corrosión en la interfaz hasta cierto punto. Además de Desulfobacterota, se ha demostrado que Proteobacteria y Bacteroidetes son los principales filos dominantes en la superficie de acero corroído en el entorno marino8. La mayoría de los microorganismos relacionados con los ciclos redox del hierro y el azufre pertenecían a las Proteobacterias75. Algunas bacterias en Proteobacteria son muy importantes para la formación de biopelículas76. Se confirmó que Bacteroidetes era el filo dominante en la biopelícula sobre la superficie de acero para la inmersión a corto plazo en agua de mar77. Las bacterias en Bacteroidetes contienen una gran cantidad de genes codificadores, que son buenos para usar biopelículas para degradar polímeros complejos (como POmp y DOM) para crear un entorno anaeróbico78. Las bacterias en Firmicutes y Actinobacteria se encuentran principalmente en ambientes de tuberías, incluidas varias bacterias Gram-positivas que pueden producir esporas para resistir la deshidratación y los ambientes extremos79. La actinobacteria también es uno de los microorganismos importantes en la vía de transmisión de energía, que puede sobrevivir en ambientes hostiles y causar corrosión por picaduras79,80.

Entre las 10 clases principales clasificadas según su abundancia relativa (Fig. 7b), se detectó la clase Gammaproteobacteri de todos los especímenes, las clases Bacteroidia, Bacilli y Clostridia compartidas por los especímenes OYT, OY-RU, AS-RU y SW- RU. En particular, la clase Alphaproteobacteria compartida por los especímenes de roya OY-RU, AS-RU y SW-RU. Clases Verrucomicrobiae, Campylobacteria y Acidimicrobiia compartidas por los especímenes cubiertos por macrofouling (OY-RU y AS-RU). Aparte de estos, OY-RU tenía clases Cyanobacteriia y Desulfovibrionia. Entre estas clases, las clases Gammaproteobacteria y Alphaproteobacteria pertenecían al filo Proteobacteria, las clases Bacilli y Clostridia pertenecían al filo Firmicutes, la clase Bacteroidia pertenecía al filo Bacteroidota, la clase Verrucomicrobiae pertenecía al filo Verrucomicrobiota, la clase Campylobacteria pertenecía al filo Campylobacterota. Según las estadísticas, Alphaproteobacteria y Gammaproteobacteria representaron el 75% entre las bacterias corrosivas cultivables.

La exposición del acero en el agua de mar y la cobertura de macrofouling dieron como resultado una formación diferente de capa de óxido y biopelícula entre la superficie del acero y la interfaz de macrofouling/acero. Los resultados indicaron cambios marcados en la composición microbiana, incluso a nivel de género (Tabla complementaria 2 y Fig. 7c). Nos enfocamos en las mejores OTU en cada espécimen con una abundancia relativa > 1%. Esto cubrió el 76,5 %, el 94,3 %, el 31,1 %, el 39,1 % y el 52,2 % en las muestras OYT, OYS, OY-RU, AS-RU y SW-RU, respectivamente.

Por lo general, después de que los microorganismos colonizaran la superficie del acero, los exopolisacáridos secretados por ellos reaccionarían con las sustancias orgánicas e inorgánicas en la superficie del metal para formar sustancias poliméricas extracelulares (EPS). Luego, las bacterias se adhirieron a la superficie metálica junto con el EPS para formar una biopelícula. Una característica importante de las biopelículas es que su pH interno, oxígeno disuelto (OD), concentración de iones y contenido orgánico son muy diferentes a los del agua de mar. En general, la mayoría de las bacterias marinas con capacidad de corrosión participan en el proceso del ciclo del hierro, el azufre y otros elementos, y participan en el proceso de corrosión al cambiar los procesos de reacción catódicos y anódicos en la superficie del metal. De acuerdo con las especies bacterianas y las características metabólicas, las principales bacterias corrosivas en el océano se pueden dividir en bacterias reductoras de sulfato (SRB), bacterias oxidantes de hierro (IOB), bacterias reductoras de hierro (IRB), bacterias productoras de ácido (APB) y bacterias productoras de limo (SPB), etc.

Al comparar las muestras de biopelículas de óxido (SW-RU, AS-RU y OY-RU), encontramos los géneros Woeseia, Pseudomonas (SPB), Comamonas, Ruegeria (SPB), Brevundimonas, Desulfovibrio (SRB), Desulfobulbus (SRB), y archaea Candidatus_Nitrosopumilus finalmente aumentaron, pero los géneros Pseudoalteromonas, Methyloversatilis (NRB) y Lactobacillus disminuyeron con la cobertura del macrofouling.

Desulfovibrio y Desulfobulbus son SRB81 típicos. Las SRB son bacterias heterótrofas que pueden obtener directamente electrones de sustratos metálicos para mantener sus propias actividades vitales. SO42− se redujeron a S2− debido a la acción de SRB, dejando un producto de corrosión típico FeS en la interfaz macroincrustante/acero, lo cual fue consistente con la detección de FeS en la capa de óxido (Fig. 2). Desulfovibrio perteneciente a la clase Deltaproteobacteria se observó como el género predominante en la capa de óxido en el ambiente de corrosión marina y se ha demostrado que es la principal causa de la CMI marina7,13,82. Brevundimonas perteneciente a la clase Alphaproteobacteria fue uno de los principales microorganismos que podrían causar corrosión al acero estructural80. Woeseia era uno de los microbios anaeróbicos facultativos, que comprendía microbios marinos quimioheterótrofos anaeróbicos facultativos, gramnegativos, oxidasa negativos y catalasa positivos83. Los grupos microbianos funcionales con modo de respiración facultativa se consideraron características típicas de las biopelículas maduras en ambientes marinos32. Los géneros formadores de biopelículas como Pseudomonas y Ruegeria dominaron la biopelícula superficial y fueron SPB típicos. Estos organismos pueden generar un ambiente anaeróbico y ácido. El polímero extracelular de Lactobacillus podría cambiar la estabilidad de la capa de óxido al transferir los cristales de la interfaz de acero al carbono, lo que podría disminuir la tasa de corrosión del acero al carbono84. En particular, la abundancia de Pseudoalteromonas disminuyó sustancialmente con la cobertura del macrofouling. Esto correspondió a un aumento en la abundancia de Desulfovibrio. Wu et al.85 estudiaron la corrosión de Desulfovibrio y Pseudoalteromonas en acero bajo en carbono Q235 en agua de mar natural y encontraron que Pseudoalteromonas agotó el OD en el agua de mar, lo que proporcionó las condiciones básicas para las actividades de vida de Desulfovibrio y causó corrosión microbiana. El agotamiento de DO cambió las bacterias dominantes en la capa de óxido de bacterias aeróbicas a bacterias anaeróbicas, por lo que la superficie de acero comenzó a verse afectada por MIC. Se observó que metiloversatilis como uno de los NRB desempeñaba un papel importante en el proceso MIC del acero al carbono en agua intersticial de bentonita sintética86. Comamonas se encontró en tuberías de gas natural, que era una de las bacterias más frecuentes y también estaba involucrada en el proceso de corrosión87. En el caso de las arqueas, Candidatus_nitrosopumilus perteneciente a la clase Nitrososphaeria ocupó una posición significativa en la interfaz macrofouling/acero. Los miembros de este género cultivaron nitrito quimioautotróficamente por oxidación aeróbica de amoníaco y tenían una alta afinidad específica por el nitrógeno reducido, lo que aseguró que compitieran con éxito con el bacterioplancton heterótrofo y el fitoplancton. Estudios anteriores han demostrado que las bacterias contribuyen principalmente a la colonización de la superficie, mientras que las arqueas rara vez se encuentran. Sin embargo, en el presente estudio, se identificaron miembros de arqueas a partir de la interfaz de superposición de macroincrustaciones. Debe reevaluarse su papel en la corrosión inducida por macroincrustaciones.

LEfSe se empleó además para identificar taxones específicos que se enriquecieron en los especímenes relacionados con la roya (Fig. 7d) y los especímenes relacionados con las ostras (Fig. 2 complementaria). A partir de los resultados, se pudo ver que la familia Desulfurivibrionaceae, incluida Desulfovibrio, se enriqueció en el espécimen OY-TU entre los especímenes relacionados con la roya, lo que demostró aún más su importante papel en la comunidad microbiana de la interfaz ostra/acero en este documento.

En conjunto, la cobertura de la macroincrustación en la superficie del acero causó impactos diferentes pero persistentes en la composición de la comunidad microbiana original en comparación con la biopelícula de óxido formada por el proceso de corrosión del acero en el ambiente del agua de mar. En el entorno del agua de mar pobre en nutrientes, la proteína y el polisacárido contenidos en las secreciones de macroincrustaciones proporcionaron la energía necesaria para el crecimiento microbiano, lo que estimuló el crecimiento de los microorganismos adheridos inicialmente a la superficie del acero. Posteriormente, junto con la formación de un ambiente anóxico suprayacente, la abundancia de bacterias anaerobias comenzó a aumentar (representada por SRB), acompañada de un cambio en la diversidad de comunidades microbianas. La secreción de organismos macroincrustantes proporciona una fuente de carbono para el crecimiento de SRB. Las fuentes de carbono son nutrientes utilizados como fuente de carbono para la formación de células microbianas y metabolitos que contienen carbono. Se ha demostrado que las fuentes de carbono juegan un papel crucial en el proceso MIC promovido por SRB88,89,90,91,92,93,94. El estudio de Liu et al.89 indicó que SRB puede sobrevivir y crecer bien en condiciones de escasez de fuentes de carbono orgánico. Además, cuanto mayor sea el tiempo de cultivo del biofilm, más rápida será la velocidad de corrosión del acero. También estudiaron la inhibición de la corrosión del acero causada por el derivado de imidazolina en presencia de SRB con inanición de carbono orgánico en agua de mar saturada de CO2 y encontraron que la corrosión fue inhibida por SRB con un recuento inicial alto en ausencia de carbono orgánico. Sin embargo, cuando el recuento inicial de SRB disminuyó, la tasa de corrosión se aceleró88. Zhao et al.92 investigaron el impacto de diferentes fuentes de carbono en las comunidades bacterianas sulfidogénicas durante la fase de puesta en marcha de biorreactores reductores de sulfato acidógenos. Observaron que la diversidad del gen 16S rRNA de las comunidades bacterianas dominantes en cada biorreactor tendía a aumentar cuando se usaba lactato, acetato/etanol, glucosa y melaza como fuentes de carbono.

Para identificar mejor el cambio en la función de la comunidad microbiana bajo las condiciones de cobertura de macrofouling, analizamos los genes de función utilizando la predicción PICRUSt (Fig. 8). Los efectos de las ostras en la interfase (Fig. 8a), los efectos de las ascidias en la interfase (Fig. 8b) y los efectos de las secreciones de las ostras (Fig. 8c) se consideraron por separado. Se encontró que la comunidad microbiana en la interfaz macroincrustante/acero respondió de manera diferente en comparación con las superficies de acero sin cobertura de macroincrustante (Fig. 8a, b). Para la interfaz cubierta de ostras (Fig. 8a), el procesamiento de la información genética, la biogénesis de los ribosomas y el sistema de fosfotransferasa (PTS) de procesamiento de transporte de membrana fueron inhibidos por un entorno hipóxico cubierto, acompañado por la fosforilación oxidativa del metabolismo fuertemente estimulada; Para la interfaz cubierta por ascidias (Fig. 8b), metabolismo de aminoácidos (como valina, degradación de leucina e isoleucina, metabolismo de triptófano, metabolismo de fenilalanina y degradación de lisina), metabolismo de lípidos, metabolismo de ácidos grasos, metabolismo energético (como fosforilación oxidativa, metabolismo de metano , y vías de fijación de carbono en procariotas), la biodegradación de xenobióticos y el metabolismo de la degradación de caprolactama, el metabolismo de terpenoides y policétidos, la degradación de geraniol y la biosíntesis de otros metabolitos secundarios (biosíntesis de butirosina y neomicina y biosíntesis de betalaína) fueron fuertemente estimulados, acompañados por el procesamiento de información genética Ribosoma También se inhibieron la biogénesis y el sistema de fosfotransferasa de procesamiento de transporte de membrana (PTS). Se pudo observar que la cobertura del macrofouling tuvo cierto impacto en las vías funcionales de la comunidad microbiana en el biofilm de roya. Además, no podía ignorarse el papel de las secreciones de macrofouling (Fig. 8c). Como puede verse, el transporte de membrana (como los transportadores y los transportadores ABC) se promovió en gran medida durante la formación de la biopelícula interfacial de óxido.

Funciones potenciales de las comunidades microbianas utilizando la predicción PICRUSt. Las rutas funcionales de la comunidad microbiana se compararon entre los grupos a con/sin cobertura de ostras, b con/sin cobertura de ascidias, cy la comunidad microbiana desde la secreción de ostras hasta la roya. La columna de la izquierda mostró la abundancia relativa de cada vía y la columna de la derecha mostró la diferencia entre los grupos. Las barras de error representan las desviaciones estándar de muestras por triplicado. d La abundancia de genes de función importantes relacionados con la aceptación de electrones terminales de la comunidad microbiana, la función de estos genes se puede encontrar en la Tabla complementaria 3. La prueba T analizó las diferencias significativas (P <0.05).

La cobertura de Macrofouling cambió las vías funcionales de la comunidad microbiana en la biopelícula de óxido. Por lo tanto, se identificaron aún más los genes de función clave relacionados con la aceptación de electrones terminales (Fig. 8d). Se observó que los genes relacionados con la respiración de oxígeno (coxA-D y ccoN-Q), desnitrificación (nar y napF-H), hierro (mtr y mtrA-C), reducción de sulfato (dsrA,B y cysI,J) estaban identificada en todos los especímenes. No es sorprendente que el gen clave dsrA y dsrB relacionado con el proceso de reducción de sulfato disimilatorio se estimulara significativamente en especímenes cubiertos de ostras (OY-RU) (P < 0.05) en comparación con los especímenes AS-RU y SW-RU debido al ambiente anóxico cubierto ( especialmente en el área cubierta por la concha calcárea de la ostra), lo cual fue consistente con el análisis taxonómico (Fig. 7). Por el contrario, los genes clave implicados en la reducción de sulfato asimilativa, como cysI y cysJ, se redujeron en la muestra OY-RU (P < 0,5). Dado que el consumo de sulfato de la interfase ostra/acero fue mayor que el de la interfase ascidia/acero, y mayor que el de la interfase de cobertura antiincrustante. Creemos que la reducción de SRB sulfato disimilatorio es una de las razones por las que el consumo de sulfato es importante. La reducción de sulfato por asimilación microbiana podría facilitar en gran medida el agotamiento del sulfato que cubre la interfaz anóxica (interfaz ostra/acero).

Además de los genes de función relacionados con el sulfato, esta regla también se reflejó en genes de función como napH, napG, nar, coxC, ccoN, ccoO, ccoP y ccoQ. Los genes napH, napG y nar se enriquecieron significativamente (P < 0,05), y los gens coxC, ccoN, ccoO, ccoP y ccoQ se redujeron significativamente (P < 0,05) en biopelículas de óxido en la interfaz ostra/acero (OY-RU) . Esta observación indicó que la interfaz anóxica cubierta por ostras estimuló la desnitrificación microbiana, pero debilitó el proceso de respiración de oxígeno de las comunidades microbianas. La mejora de los modos de respiración anaeróbica en la superficie del acero se debió a la formación de microambientes anaeróbicos heterogéneos dentro del engrosamiento y la complicada capa de óxido, donde existían las áreas anaeróbicas. El proceso de desnitrificación microbiana podría ocurrir en tales condiciones anaeróbicas, que se han observado en ambientes marinos anóxicos7,95,96.

En el ambiente marino, los macroorganismos o microorganismos pueden producir ataques localizados como picaduras, corrosión por grietas en la superficie del metal, se utilizan varios medios antiincrustantes para evitar que esto suceda97,98. En este estudio, se observaron grandes diferencias en la composición y diversidad de las comunidades microbianas en superficies de acero oxidadas con/sin macrofouling cubiertas cuando colocamos muestras en agua de mar en el mismo lugar durante nueve meses. Mientras tanto, los resultados de la observación de la morfología de la interfase demostraron que las ostras y ascidias adherentes habían causado una corrosión marina compleja de la superficie de acero contaminada, que se manifestaba como corrosión local en la interfase ostra/acero, mientras que la corrosión uniforme en la interfase ascidia/acero. Y los resultados de la composición de la herrumbre mostraron que, además de la goethita, la akageneita, la lepidocrocita, la magnetita y el GR(SO42−), la mackinawita solo se generó en la interfase macrofouling/acero. Todo esto implicaba que se había producido MIC en la interfase macrofouling/acero, y que las SRB estaban involucradas en el proceso de corrosión acelerada. Por lo tanto, llevamos a cabo un estudio comparativo sobre la composición y las funciones potenciales de la comunidad microbiana en la interfaz-roya cubierta por macroincrustaciones. Los tres conjuntos de muestras SW-RU, OY-RU y AS-RU proporcionaron apoyo de datos para el análisis cuantitativo de la comunidad microbiana en la biopelícula de la capa de óxido de la interfaz cubierta por macroincrustaciones y la contribución de la comunidad microbiana al proceso de corrosión de la interfaz.

Nuestros primeros resultados mostraron que para la interfaz cubierta por ostras, debido a la existencia del "efecto de sombreado", la concha calcárea de la ostra fuertemente adherida impedía la difusión de oxígeno y sustancias en el área cubierta de la interfaz, lo que conducía a la formación de una celda de concentración de oxígeno, lo que acelera aún más la velocidad de corrosión en el lugar donde se ha formado la grieta3. El más crítico de este proceso no solo determinó el proceso catódico de corrosión del metal, sino que también determinó la composición de microorganismos en la biopelícula de óxido debido al cambio de concentración de oxígeno. En esta investigación, en comparación con la muestra no cubierta por macroincrustaciones (SW-RU), se observaron diferentes comunidades microbianas y corrosión localizada significativa en las biopelículas de la capa de óxido en la interfaz cubierta por ostras (OY-RU) (Fig. 1), lo que sugiere fuertemente que dicha corrosión estaba relacionada con las CIM. Con las ostras cubiertas por la superficie de acero, la SRB se enriqueció fácilmente en estos ambientes debido a las altas concentraciones de iones de sulfato82,99, lo cual fue probado por la SRB enquirada (Fig. 7) y el gen clave correspondiente dsr (Fig. 8). El alto consumo de sulfato y la alta reducción de sulfato microbiano en las biopelículas de óxido de la interfaz ostra/acero, lo que significó que se crearon entornos anaeróbicos para SRB debido al "efecto de sombra" de la concha calcárea. La MIC inducida por SRB promovió la formación y el desarrollo de picaduras de corrosión, lo que indujo la reducción de sulfato en el agua de mar y se acompañó de la generación de FeS. Por lo tanto, propusimos que en los procesos de corrosión afectados por la ostra, la SRB no era la razón principal de la aparición de CIM del acero en el agua de mar hasta que las larvas de la ostra comenzaron a colonizar la superficie del acero oxidado. Durante la colonización de las ostras, los géneros formadores de biopelículas (SPB) Pseudomonas y Ruegeria se adhirieron primero a las superficies de acero y formaron la biopelícula. Después de que las ostras colonizaran la superficie de acero con la formación de zonas anaeróbicas localizadas y microambientes heterogéneos en el área cubierta, las bacterias asociadas a SRB y SPB proliferaron y promovieron la transición de biopelículas de óxido (Fig. 7). Esto podría explicar por qué los genes anaeróbicos relacionados con la reducción de NO3− se enriquecieron significativamente (P < 0,05), y los gens coxC, ccoN, ccoO, ccoP y ccoQ se redujeron significativamente (Fig. 8d), acompañados de un enriquecimiento de SRB en las interfaces de superposición de ostras. (Figura 7). Estos factores aceleraron la corrosión por grietas en la interfase ostra/acero.

Noblemente, estos fenómenos no condujeron a la misma corrosión por grietas en la interfase ascidia/acero. Esto puede explicarse por la abundancia de microorganismos dominantes y las diferencias en la concentración de oxígeno en las interfases ascidia/acero y ostra/acero. Debajo de la ascidia cubierta todavía había un ambiente aeróbico debido a la capacidad de conductividad y difusividad de iones del cuerpo de la ascidia. La alta concentración de oxígeno condujo a la baja actividad de SRB, por lo que SRB rara vez participa en el proceso MIC en la interfaz ascidia/acero. Por el contrario, las brechas existentes en la interfaz ostra/acero y los nutrientes proporcionados por las secreciones dieron como resultado una alta actividad de las SRB, lo que provocó la severa CIM en sitios específicos.

En resumen, se utilizaron experimentos de campo, caracterizaciones de laboratorio y tecnología de secuenciación de alto rendimiento para investigar las posibles comunidades microbianas en la interfaz macroincrustante/acero, que pueden conducir a una corrosión microbiológicamente influenciada (MIC, por sus siglas en inglés). El estudio encontró que el entorno microecológico cubierto por la macroincrustación, así como la fuente de nutrientes proporcionada por las secreciones de la macroincrustación, estimularon la abundancia y diversidad de comunidades microbianas en la interfaz. Específicamente, se encontró que las bacterias reductoras de sulfato (SRB) estaban involucradas en el proceso MIC. Se encontró que los procesos de MIC difieren significativamente entre las interfaces cubiertas por incrustaciones duras y blandas. En comparación con las ascidias, la interfaz ostra/acero creó una zona anaeróbica local debido a la baja difusividad iónica de la concha calcárea de la ostra. Este ambiente anaeróbico estimuló el crecimiento de SRB, lo que llevó a un mayor contenido de FeS y una corrosión localizada severa. En particular, los SRB Desulfovibrio y Desulfobulbus, así como el gen de función relacionado con SRB dsr, aumentaron, mientras que se encontró que disminuyó el gen de función relacionado con el oxígeno coxC, ccoN, ccoO, ccoP y ccoQ.

El documento no proporcionó datos para respaldar la hipótesis de que una mayor abundancia y diversidad microbiana promuevan directamente la corrosión del acero. Sorprendentemente, el estudio encontró que las superficies de acero sin cobertura de macroincrustaciones tenían las comunidades microbianas más ricas, pero experimentaban una MIC menos severa. Creíamos que solo una pequeña fracción de las numerosas comunidades microbianas presentes estaba realmente involucrada en el proceso de MIC interfacial, con SRB jugando un papel clave. Se debe prestar atención a las diferencias de la comunidad microbiana debidas a cambios en el microambiente local y al crecimiento de bacterias anaerobias durante el proceso de CIM. Si lo hace, nos ayudará a comprender mejor el mecanismo de corrosión localizada en la interfaz y cuantificar con precisión la contribución específica de los microorganismos en los procesos de corrosión complejos.

Se seleccionó acero de baja aleación y alta resistencia (AISI 4135, Shougang New Steel Co., Ltd, China) como acero de prueba en este trabajo, que tiene la siguiente composición de elementos (% en peso): C 0.399, S 0.0144, P 0.0146 , Si 0,293, Mo 0,204, Mn 0,509, Ni 0,0804, Cr 0,903 y Fe resto. Se eligieron especímenes cilíndricos de 1 cm de diámetro y 1 cm de espesor y se embebieron en resinas, exponiendo un área superficial de 0,785 cm2 (Fig. 9a). Luego, estos especímenes se sumergieron en el agua de mar por debajo de la línea de marea baja, donde era más probable que se adhirieran las macroincrustaciones. El sitio de exposición de campo estaba ubicado frente a un muelle en la bahía de Jiaozhou, Qingdao, China (N 120 ° 15'4 ″, E 35 ° 59'11 ″)). Después de nueve meses de inmersión en agua de mar desde el 1 de marzo de 2021 hasta el 1 de diciembre de 2021, el espécimen cilíndrico cubierto por una ostra (Fig. 9b), cubierto por ascidias (Fig. 9c) y no cubierto por macrofouling (Fig. 9d ) fueron recuperados. Debido a que la adherencia de los organismos macroincrustantes es incontrolable, el diseño experimental es el siguiente: se colgaron múltiples especímenes paralelos en el mismo lugar y se observó la cobertura de macroincrustaciones a intervalos regulares. Después de identificar algunos especímenes con fijación de ostras y ascidias, se seleccionaron como especímenes objetivo. Después de un período de tiempo, los especímenes objetivo con fijación de ostra y ascidia se recolectaron por separado, y también se eligieron y recolectaron especímenes sin fijación de macroincrustaciones como grupo de control. Luego, las capas de óxido y las biopelículas in situ se recolectaron en la interfaz de macroincrustaciones/acero para una mayor secuenciación y análisis de la composición del óxido. Después de recolectar la muestra, todas las muestras de óxido y la biopelícula se transfirieron a tubos de centrífuga estériles100. Se recolectaron tres especímenes paralelos en diferentes puntos y se les asignó SW-RU (la capa de óxido o biopelícula en la interfaz de acero que no está cubierta por macroincrustaciones), AS-RU (la capa de óxido o biopelícula en la interfaz de ascidia/acero), OY- RU (la capa de óxido o biopelícula en la interfase ostra/acero), OY (la capa de óxido o biopelícula en las secreciones de las ostras) y OYT (la capa de óxido o biopelícula en los tejidos de las ostras). Para las muestras de óxido (SW-RU, OY-RU y AS-RU), primero elimine la macroincrustación cubierta de la superficie del sustrato de acero y luego recoja la capa de óxido y las biopelículas con pinzas estériles. Para las muestras OYS y OYT, utilice primero unas pinzas estériles para abrir la concha de la ostra. Luego, usó una pipeta estéril para recolectar las secreciones de ostras (OYS) y usó una cuchilla quirúrgica estéril para cortar y recolectar los tejidos de ostras (OYT). Todas las muestras recolectadas se mantuvieron en una caja de hielo, se transportaron al laboratorio lo antes posible y se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis.

un espécimen cilíndrico; b–d Espécimen cilíndrico b cubierto por una ostra, c cubierto por ascidias y d no cubierto por macrofouling después de nueve meses de inmersión en agua de mar.

Para la observación de la morfología de la interfaz macroincrustante/acero y el análisis de la capa de óxido, primero se eliminó la macroincrustación cubierta y luego se llevó a cabo la composición del óxido y la caracterización morfológica de la interfaz macroincrustante/acero. La morfología de la superficie de acero cubierta de óxido después de eliminar la macroincrustación se investigó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, Regulus 8100, Hitachi, Japón). La superficie de acero sin óxido se observó mediante un microscopio láser de medición 3D (LSCM, LEXT 3D OLS5000, Olympus, Japón) después de eliminar la capa de óxido usando ácido clorhídrico al 20 % en volumen con hexametilentetramina al 1 % en volumen. La capa de óxido recolectada se mezcló con glicerol y se secó al vacío por congelación para evitar la oxidación y se mantuvo en recipientes al vacío. Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS, EscaLab 250Xi, Thermo Fisher Scientific, América), difracción de rayos X (XRD, Ultima IV, Rigaku, Japón) y espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR, Nicolet iS10, Thermo Fisher Scientific, USA) se utilizaron técnicas para la caracterización de la roya. Para el análisis XPS, los datos XPS se recopilaron utilizando un espectrómetro Thermo Fisher ESCALAB 250Xi con radiación monocromática Al Kα y compensación de carga asistida por argón. Para los espectros detallados se utilizó un tamaño de paso de 0,05 eV, un tiempo de permanencia de 100 ms y una energía de paso de 10 eV. La calibración se realizó para eliminar las alteraciones inducidas por voltaje en los espectros de electrones. Los espectros se registraron en un ángulo de despegue de 90° y todas las energías de enlace se corrigieron por carga a la señal C 1s, que se fijó en 284,6 eV. Para la caracterización de los óxidos de hierro, se adquirieron escaneos de alta resolución de los picos C 1s, S 1s, O 1s y Fe 2p. Para el análisis XRD, las muestras de óxido se caracterizaron usando un difractómetro Rigaku XRD con una radiación Cu Kα (λ = 1.5406 Å). Los datos de difracción se recopilaron en un rango de 2θ de 5 a 90° con una velocidad de exploración de 5°/min. Para el análisis FT-IR, la muestra de óxido se molió en un polvo fino y se prensó en un disco usando KBr seco espectroscópicamente puro al vacío. Los espectros se recolectaron en un rango de longitudes de onda (400–4000 cm−1) a una resolución de 2 cm−1. Los espectros de fondo se recogieron antes de cada muestra individual.

El ADN extraído de las muestras por el método SDS se usó para la secuenciación, luego se usó electroforesis en gel de agarosa para verificar la pureza y la concentración del ADN. Para la amplificación por PCR se utilizaron cebadores específicos con Barcode, Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer (New England Biolabs, Inglaterra) y enzimas de alta eficiencia y alta fidelidad101. Los genes de ARNr 16S se amplificaron utilizando los conjuntos de cebadores 515F/806R. La integridad y la longitud aproximada del ADN se examinaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % y los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (QIAGEN, Hilden, NRW, Alemania)102,103. Las bibliotecas de PCR se realizaron con el kit de preparación de muestras sin PCR de ADN TruSeq® (Illumina, San Diego, CA). Después de la cuantificación con Qubit y Q-PCR, las bibliotecas de PCR calificadas se secuenciaron en la plataforma Illumina NovaSeq6000.

Después de truncar las secuencias del código de barras y del cebador de acuerdo con la secuencia del código de barras y la secuencia del cebador de amplificación por PCR, se usó FLASH (V1.2.7) para empalmar las lecturas de cada muestra para obtener etiquetas sin procesar104. El control de calidad se realizó en las etiquetas sin procesar (la longitud de la secuencia es de 200 a 10 000 pares de bases, pares de bases idénticos consecutivos N < 6; bases difusas N < 1, Q < 25), luego se usó el software Fastp para filtrar las etiquetas sin procesar empalmadas para obtener etiquetas limpias. Después de eliminar las secuencias quiméricas, se obtuvieron las etiquetas efectivas finas105. Para el análisis posterior del índice de diversidad y la información de abundancia de OTU, se utilizó el algoritmo Uparse (Uparse v7.0.1001)106 para agrupar todas las etiquetas efectivas de todos los especímenes y las secuencias se agruparon en OTU (unidades taxonómicas operativas) con una similitud de secuencia del 97 %. La anotación de especies se realizó en secuencias de OTU, y el análisis de anotación de especies se realizó utilizando el método Mothur y la base de datos SSUrRNA (SILVA138.1)107,108 para obtener información taxonómica y composición de la comunidad en cada nivel taxonómico: reino, filo, clase, orden, familia, género, especie.

El índice de diversidad alfa (diversidad α) se utilizó para indicar la diversidad de la comunidad microbiana dentro de las muestras. Se utilizó el cálculo QIIME y el software R para cubrir la profundidad de secuenciación109. Los índices de otus observados, Chao1, Shannon, Simpson y ACE se calcularon con el software QIIME (versión 1.9.1), y las curvas de dilución y las curvas de rango de abundancia se dibujaron con el software R (versión 2.15.3)110. El índice de diversidad beta (diversidad β) se utilizó para analizar la composición de la comunidad microbiana de diferentes especímenes. En función de la distancia no ifrac ponderada, la distancia Bray-Curtis basada en OTU se extrajo de la escala multidimensional no métrica (NMDS)111,112. El análisis de conglomerados UPGMA se realizó con una matriz de distancia unifrac ponderada y una matriz de distancia unifrac no ponderada. Los resultados del agrupamiento se integraron y se mostraron con la abundancia relativa de especies a nivel de phylum en cada espécimen113,114. Análisis PCA aplicado para extraer dos ejes que mejor reflejen las diferencias entre especímenes111. La distancia unifrac se calculó mediante el software QIIME (versión 1.9.1) y se construyó el árbol de agrupación de muestras UPGMA. Los gráficos PCA y NMDS también se dibujaron usando el software R (Versión 2.15.3). Los genes de función potencial se anotaron en la base de datos KEGG utilizando la predicción PICRUSt115,116. El cladograma de taxones discriminatorios se identificó en los grupos relacionados con la roya mediante el análisis discriminante lineal (LDA) basado en Kruskal-Wallis con una puntuación logarítmica >3,5 y P = 0,05 utilizando el software LEfSe (V1.0)7,117. La abundancia relativa de cada taxonomía fue el valor promedio de eso por triplicado. Se usó la prueba T para determinar la diferencia en los genes funcionales individuales entre diferentes tratamientos7.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de secuenciación de los 15 especímenes obtenidos se depositaron en la base de datos NCBI Short Read Archive (SRA) con el número de acceso de Bioproject PRJNA865886, con los números de Biospecimen SAMN 30139936–30139950.

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Los autores desean agradecer el apoyo financiero del trabajo del Plan Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (No. 2022YFB2603000), el Programa Clave de I+D de la provincia de Shandong, China (No. 2022CXPT027) y los Proyectos de Investigación de Barcos de Alta Tecnología del MIITC. (No. MC-202003-Z01-02).

Key Laboratory of Marine Environmental Corrosion and Bio-fouling, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Qingdao, 266071, China

Zhengquan Wang, Xiutong Wang, Yanliang Huang y Baorong Hou

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 100049, China

Zhengquan Wang, Xiutong Wang y Yanliang Huang

Centro de megaciencias oceánicas, Academia de Ciencias de China, Qingdao, 266071, China

Zhengquan Wang, Xiutong Wang y Yanliang Huang

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ZW redactó el documento y realizó el trabajo experimental bajo la supervisión de XW Todos los autores evaluaron y visualizaron los resultados. XW y YH revisaron y editaron el documento.

Correspondencia a Xiutong Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Wang, Z., Wang, X., Huang, Y. et al. Conocimientos metagenómicos sobre las comunidades microbianas hipóxicas y de nutrientes en la interfaz de macroincrustaciones/acero que conducen a una CIM grave. npj Mater Degrad 7, 41 (2023). https://doi.org/10.1038/s41529-023-00365-2

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Recibido: 19 enero 2023

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41529-023-00365-2

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