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Apr 21, 2023

Los depósitos de lípidos revelan el estado del coral

ISME Comunicaciones volumen 3,

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 29 (2023) Citar este artículo

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Los arrecifes de coral en todo el mundo están amenazados por el estrés ambiental. La disminución observable en la cubierta de coral se debe principalmente a la ruptura cada vez más intensa de la simbiosis de los corales, un proceso conocido como 'blanqueamiento'. La sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se considera un factor clave del blanqueamiento de corales, donde el estrés ambiental conduce a una mayor expresión de ROS. Para explorar el vínculo entre el daño de ROS y el estado simbionte, medimos la peroxidación de lípidos (LPO), una forma ubicua de daño de ROS, en las reservas de lípidos de células de algas endo- y ex-simbiontes individuales de tres especies de coral, utilizando microscopía confocal y un colorante fluorescente sensible al hidroperóxido de lípidos. Encontramos que la LPO era mayor en los endosimbiontes, mientras que el volumen de lípidos era mayor en las células exsimbiontes. El análisis de conglomerados reveló tres perfiles metabólicos que diferencian las células endosimbióticas (#1: alto LPO, bajo contenido de lípidos) y ex-simbióticas (#3: bajo LPO, alto contenido de lípidos), con el grupo intermedio (#2) que contiene ambos tipos de células. El estrés por calor hizo que los endosimbiontes de Pocillopora acuta se alejaran del grupo n.º 1, lo que sugiere que este grupo representa células en simbiosis sana/estable. Nuestro estudio ofrece un nuevo medio para evaluar la simbiosis del coral, lo que demuestra que la proporción de LPO simbionte combinada con el volumen de almacenamiento de lípidos es un marcador metabólico sólido para el estado de la simbiosis a nivel celular.

Los corales escleractinios forman la base de los arrecifes de coral y deben su éxito ecológico a su interacción con algas simbióticas unicelulares [1] pertenecientes a la familia Symbiodiniaceae [2]. La relación intracelular entre el alga y su huésped ha permitido que los corales prosperen en las aguas pobres en nutrientes de los trópicos durante más de 200 millones de años [3]. En simbiosis, el huésped cnidario proporciona al alga nitrógeno reducido y otros nutrientes derivados de su estilo de vida heterótrofo, mientras que el simbionte de algas apoya el metabolismo de los huéspedes al proporcionar carbono producido fotosintéticamente [4,5,6]. Debido a la complejidad de esta relación y, hasta hace poco [7], a la incapacidad de realizar experimentos in vitro en unidades simbióticas funcionales individuales (es decir, célula huésped intacta con endosimbiontes), nuestro conocimiento sobre los mecanismos celulares fundamentales que sostienen las interacciones simbióticas, incluyendo todavía faltan aquellos que sustentan la expulsión selectiva de algas simbiontes (ya sea iniciadas por el huésped o el simbionte) del tejido del huésped [1, 8].

Como parte de un mecanismo regulador de costo-beneficio [9], los corales controlan la densidad de simbiontes en el tejido restringiendo su tasa de crecimiento, posiblemente a través de la limitación de nitrógeno [10], y digiriendo o expulsando el exceso de células simbiontes a medida que crecen y se dividen [ 1, 11]. Sin embargo, la expulsión de simbiontes también puede ocurrir en respuesta a condiciones desfavorables que causan inestabilidad metabólica dentro del simbionte, el huésped o ambos socios. Esto es evidente por la multitud de perturbaciones ambientales que aumentan la tasa de expulsión, incluidas temperaturas bajas [12] o altas y/o mucha luz [13,14,15], oscuridad [16], mayor disponibilidad de carbono orgánico disuelto como como glucosa [17], limitación de fosfato [18] y salinidad reducida [19]. La pérdida excesiva de simbiontes y su pigmento fotosintético del tejido del coral, un proceso conocido como 'blanqueamiento', suele ser fatal para el coral, ya que no puede mantener su metabolismo sin recibir la energía producida por sus algas simbióticas. En las últimas décadas, el blanqueo inducido por las altas temperaturas se ha convertido en el principal impulsor del deterioro de la salud y la extensión de los arrecifes en todo el mundo [20]. A pesar del conocimiento establecido de los factores ambientales que inician el blanqueo, se sabe poco sobre el desencadenante celular del deterioro de la simbiosis del coral, ni en qué socio se origina el desencadenante.

En las células eucariotas, la inestabilidad metabólica durante el estrés fisiológico puede resultar en un aumento de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la célula debido a un desequilibrio entre la producción de los procesos metabólicos y la extinción [21]. A menos que se controlen adecuadamente, las ROS pueden causar daño a los componentes celulares internos a través de la oxidación del ADN, las proteínas y los lípidos [22], lo que en casos extremos provoca la apoptosis y la muerte de la célula. Debido al entorno de luz y temperatura a menudo alta del arrecife, la maquinaria fotosintética es particularmente propensa a la producción y daño de ROS [23]. Por esta razón, el papel del estrés fotosintético del simbionte en el deterioro de la simbiosis de los corales ha sido durante mucho tiempo un foco principal de la investigación sobre el blanqueamiento de corales [14, 24, 25, 26], donde se ha propuesto el exceso de ROS producido en el fotosistema dañado por el calor. filtrarse en la célula huésped e iniciar la ruptura de la simbiosis [27, 28]. La participación de ROS en el proceso de blanqueo inducido por calor y luz ha sido impulsada por numerosos estudios que muestran observaciones correlativas de un mayor daño celular por ROS y/o antioxidantes en el simbionte y el huésped con el aumento de la expulsión del simbionte [15, 29, 30]. Sin embargo, estudios recientes han cuestionado el origen de las ROS con evidencia que apunta a un papel de las ROS producidas en la propia célula huésped [31, 32]. Es importante destacar que la diversidad de respuestas observadas revela una multitud de caminos posibles que conducen a la ruptura de la simbiosis, que probablemente depende de la capacidad de recuperación de cada socio a diferentes factores estresantes.

En el presente estudio, nuestro objetivo fue investigar el papel potencial de la inestabilidad metabólica en la expulsión de células de algas endosimbióticas del tejido coralino. Exploramos el nivel de peroxidación de cuerpos lipídicos discretos como una medida del exceso de producción de ROS y, por lo tanto, la inestabilidad metabólica dentro de los endosimbiontes coralinos y las células exsimbiontes (células de algas dentro del tejido coralino pero no encerradas en una membrana huésped). La peroxidación de lípidos (LPO) y la formación de hidroperóxidos de lípidos es una consecuencia común del aumento de ROS celular y, por esta razón, la LPO se considera un indicador sensible del daño de ROS en las células vivas. Descubrimos que el nivel de peroxidación de los cuerpos lipídicos era más alto en las células de algas endosimbióticas en comparación con los exsimbiontes y que el estrés por calor causó una disminución en la proporción de endosimbiontes con LPO alta, lo que sugiere que la LPO alta es una firma de simbiosis activa. Con base en estos hallazgos, argumentamos que la proporción de LPO a la acumulación de lípidos en las algas endosimbióticas de coral es un fuerte indicador del estado de la simbiosis y que este marcador metabólico se puede usar para investigar las características clave de la descomposición de la simbiosis en estudios futuros.

Se recolectaron fragmentos de cuatro colonias individuales de los corales ramificados Pocillopora acuta, Porites compressa y Montipora capitata (~15 cm de diámetro), del plano del arrecife (espaciados al menos 10 m, ~1 m de profundidad) frente a la Isla del Coco (Moku o Loʻe ) en Kaneohe Bay, Oahu, Hawái. Los corales se mantuvieron (como fragmentos completos) durante la duración del estudio en mesas cubiertas (50% de tela de sombra), al aire libre, de flujo continuo (volumen ~130 L, profundidad ~15 cm) con suministro continuo de agua de la bahía (~5 L min−1). Durante el estudio de mayo de 2018, la temperatura del agua en la bahía osciló entre 23,5 y 25,5 °C (http://www.pacioos.hawaii.edu/weather/obs-mokuoloe/).

Se cortaron fragmentos de coral individuales (~2 cm de longitud) de su respectiva colonia madre inmediatamente antes del procesamiento y análisis. Para asegurar la consistencia en la condición fisiológica (es decir, la etapa diurna) de las colonias de coral, el muestreo se llevó a cabo entre las 12:00 y las 14:00. Todos los fragmentos se procesaron para el análisis de fluorescencia como se describió anteriormente [33]. Brevemente, el fragmento de coral se colocó en un tubo falcon de 50 ml que contenía 3 ml de agua de mar filtrada y se golpeó contra una superficie dura para liberar las células gastrodérmicas (consulte la ref. [33] y SI para obtener más detalles sobre este método de extracción). Posteriormente, 1,5 mL de la suspensión de tejido resultante se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó suavemente (~30 RCF durante 30 s), seguido de la eliminación del sobrenadante y la resuspensión en 1,0 mL de 0,2 µm de agua de mar filtrada (FSW). Después de un segundo lavado como se describe, las células restantes se resuspendieron en 0,5 ml de FSW y se añadió colorante fluorescente (Kit de peroxidación de lípidos Image-iT®, ThermoFisher Scientific, EE. UU.) hasta una concentración final de 10 µM. La incubación se llevó a cabo en la oscuridad durante 20 min en una cabina de cultivo a 25 °C. Finalmente, las células se lavaron dos veces en FSW para eliminar el exceso de colorante, se centrifugaron suavemente (~30 RCF durante 30 s) y se resuspendieron en 50 µL de FSW y se analizaron inmediatamente en el microscopio confocal. Las células diana incluían células de algas 'ex-simbiontes', es decir, células de algas extraídas del interior del tejido coralino pero no encerradas en una célula huésped (es decir, ya no simbióticas) según lo confirmado por inspección visual, y células huésped gastrodérmicas que albergan dos algas endosimbióticas ( para facilitar la identificación visual de células ex simbióticas individuales durante el procesamiento de imágenes).

Para verificar que los perfiles de lípidos de los ex-simbiontes extraídos del tejido del coral fueran equivalentes a los de las células de algas completamente expulsadas, se obtuvieron células de algas expulsadas del coral duro Pocillopora acuta mediante un tratamiento térmico a corto plazo de tres colonias. Las colonias se colocaron en un acuario (50 l) colocado dentro de la mesa de flujo utilizado para el mantenimiento de los corales (aguas abajo de los corales que se mantienen) para garantizar un campo de luz similar al de los controles. El agua del tanque de tratamiento se reponía continuamente con agua de mar fresca (~1 L min-1) y se calentaba a ~30 °C durante 3 días (~1,5 °C/día) usando dos calentadores de acuario de 30 W. Las células simbiontes expulsadas se recogieron colocando cada fragmento de coral en vasos de precipitados de plástico de 0,4 l que contenían agua de mar filtrada a 0,2 µm precalentada. Los vasos de precipitados se hicieron flotar dentro del acuario de tratamiento durante 3 h, después de lo cual se retiraron los fragmentos de coral y el agua se filtró en filtros individuales de 5 µm mediante vacío suave. Las células filtradas se resuspendieron inmediatamente en 4 ml de agua de mar filtrada y se centrifugaron para tinción fluorescente como se describe anteriormente.

El efecto del estrés por calor en la LPO de las reservas de lípidos en endo y exsimbiontes se investigó en base a los datos de un estudio separado también realizado en el Instituto de Biología Marina de Hawái (HIMB) y que se publicó anteriormente [33]. A los efectos del presente estudio, los datos se han vuelto a analizar utilizando la misma metodología que para los nuevos datos (ver a continuación) y se presentan aquí con detalles que no se han descrito previamente y en un nuevo contexto. Se puede encontrar una descripción detallada de la metodología de muestreo, mantenimiento e imágenes para el estudio anterior en Nielsen et al. [33] y el SI asociado. Brevemente, se recolectaron tres colonias de Pocillopora acuta del plano del arrecife (~1 m de profundidad) alrededor de la Isla Coco en Kaneohe Bay, Oahu, Hawái y se mantuvieron en mesocosmos sombreados de flujo continuo (vol: 3 m3, flujo: ~180 L h- 1, luz: mediodía máximo ~400 µmol fotones m−2 s−1, ciclo de luz natural día-noche). Un conjunto de fragmentos de coral se enfrió para mantener la temperatura por debajo de los 27 °C, mientras que un segundo conjunto se sometió a calentamiento diario (un ciclo día-noche con fluctuaciones naturales de 27 °C a 31 °C), que durante las tres semanas de incubación resultó en ~50% de reducción en la densidad de simbiontes tisulares (blanqueamiento). La incubación, el muestreo y el análisis de las células se llevaron a cabo como se describe para el presente estudio.

Se utilizó el colorante fluorescente proporcional Image-IT™ basado en el reactivo BODIPY® 581/591 C11 para detectar el estado de peroxidación de los cuerpos lipídicos dentro de las células de algas. Según el fabricante, el reactivo se localiza en todas las membranas lipídicas y tras la oxidación por hidroperóxidos lipídicos muestra un cambio en la emisión de fluorescencia máxima (lípidos reducidos ex/em: 581/590, lípidos oxidados ex/em: 488/510). El tinte se une fuertemente dentro de la célula, es insensible al pH y muy estable a la luz [34]. Las células teñidas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia confocal (LSM 710, Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipada con una cámara ambiental de temperatura controlada (Incubator Xl S Examiner, Zeiss, Oberkochen, Alemania), como se detalló anteriormente [33]. Las células endosimbióticas de gastrodermo que contenían dos simbiontes de algas (para una fácil identificación) y exsimbiontes (no simbióticos pero aún dentro del tejido coralino) se ubicaron visualmente bajo un campo brillante y posteriormente se tomaron imágenes a 630X (Zeiss Plan-apocromático 63×/1.40 Oil DIC M27 lens ). Las imágenes de fluorescencia se realizaron utilizando láseres de 561 nm y 488 nm para la excitación de lípidos reducidos y oxidados, respectivamente, con rangos de recolección fijos e intensidades de láser (tamaño de orificio: 1,51 AU, resolución de imagen: 512 × 512 px [135 × 135 μm], permanencia de píxel 1,58 μs, sin promediar, grosor z ~1,0 μm). Para las tinciones fluorescentes, el tiempo de exposición se ajustó para minimizar la autofluorescencia en cualquiera de los canales fluorescentes utilizando células de control sin teñir. En todos los casos, la autofluorescencia fue insignificante en comparación con la intensidad de la tinción fluorescente.

Las mediciones de detección, cuantificación y fluorescencia de cuerpos lipídicos dentro de cada célula se llevaron a cabo utilizando una macro personalizada en ImageJ/Fiji [35, 36] (para obtener una descripción detallada del método, consulte SI). Todos los datos de imagen extraídos se analizaron utilizando R [37]. Se calculó la relación de fluorescencia (oxidada/reducida) de cada cuerpo lipídico y se utilizó la relación de fluorescencia promedio de todos los cuerpos lipídicos dentro de cada célula para análisis posteriores. Mediante el uso de un enfoque radiométrico, se eliminó cualquier sesgo potencial en las mediciones debido a la variación en la concentración de tinte dentro de la célula o el cuerpo lipídico. Se generó una estimación del volumen corporal total de lípidos por célula como la suma del área de todos los ROI del cuerpo de lípidos dentro de una célula multiplicada por el grosor focal de la capa de imagen (~1 µm). Para las células endosimbióticas, el promedio de las dos células dentro de una célula gastrodérmica se presenta como una medida. Los cuerpos de inclusión grandes, redondos y altamente fluorescentes que a veces se encuentran en las células simbiontes de algas se excluyeron del conjunto de datos utilizando límites de rango de tamaño fijo y relación de fluorescencia basados ​​en la curación manual.

Todos los análisis se realizaron con R Statistical Software (v4.1.2; R Core Team 2021). Dado que el enfoque de este estudio fue comprender los cambios fisiológicos entre los tipos de células dentro de las especies de corales, para comparar mejor los patrones entre especies, todos los datos se normalizaron a la media del valor de las células endosimbióticas respectivas para cada especie. Los datos para la comparación se verificaron en cuanto a normalidad y homocedasticidad utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente. Los datos que no cumplían con los supuestos se transformaron logarítmicamente o con raíz cuadrada y se verificó la distribución normal usando qqplot antes de ejecutar las pruebas estadísticas. Las diferencias entre los tipos de células se analizaron con modelos lineales de efectos mixtos sobre los valores medios de las colonias y la colonia como factor aleatorio utilizando la función lmer del paquete R 'lme4' [38], con parámetros estimados utilizando la máxima verosimilitud restringida (REML). Para análisis que incluyen grupos múltiples, se generaron tablas ANOVA para términos de efectos fijos con el método de Satterthwaite para grados de libertad del denominador y estadístico F utilizando la función anova en el paquete R lmerTest [39]. Los datos se consideraron significativos a P < 0,05. El análisis de conglomerados se realizó utilizando el algoritmo K-means (distancia euclidiana) del paquete R 'cluster' [40]. El número óptimo de grupos se evaluó usando 'Total dentro de la suma de cuadrados', 'silueta' y 'estadística de brecha' con 100 muestras de arranque de Monte Carlo usando la función fviz_nbclust del paquete R 'factoextra' [41].

La naturaleza altamente lipófila y ratiométrica del colorante sensible a la peroxidación de lípidos empleado [34] significó que, utilizando microscopía confocal de fluorescencia, pudimos medir el nivel de peroxidación y evaluar el volumen total de las reservas de lípidos (oxidados y reducidos, combinados) dentro de las células de algas individuales. Mientras que otras membranas lipídicas pueden estar más cerca del origen de la producción de ROS y, por lo tanto, más propensas a la peroxidación que los cuerpos de almacenamiento de lípidos, como los de los tilacoides de los cloroplastos, decidimos centrarnos en los cuerpos lipídicos para evaluar la LPO debido a su ubicación espacial. naturaleza discreta y una fuerte señal del tinte fluorescente, lo que permite una delineación clara durante el procesamiento de la imagen y, por lo tanto, una alta sensibilidad en nuestras mediciones.

Similar a los resultados de nuestro estudio anterior sobre el coral duro Acropora millepora [42], encontramos que, en promedio, las células ex-simbióticas (es decir, no simbióticas) contenían mayores cantidades de lípidos (como cuerpos lipídicos) en comparación con sus contrapartes endosimbióticas ( M. capitata: T(4) = 2,97, P = 0,041, P. compressa: T(2) = −20,74, P = 0,0023, P. acuta: T(4) = −6,32, P = 0,0032). Si bien solo se incluyeron células huésped con dos endosimbiontes para el análisis en este estudio, los endosimbiontes dentro de las células huésped de un solo simbionte mostraron un perfil de lípidos similar al de las células endosimbiontes dobles (Fig. S1 complementaria y resultados asociados), lo que verifica que el bajo contenido de lípidos observado en los endosimbiontes en los datos presentados no fue el resultado de una división reciente de las células de algas en el hospital y que las células que denominamos 'ex-simbiontes' no eran células de algas separadas mecánicamente de su célula huésped durante el procesamiento. Para verificar aún más que las células ex-simbiontes eran representativas de las células expulsadas de la colonia de coral, comparamos los perfiles de lípidos de las células ex-simbiontes con las células expulsadas obtenidas de las mismas colonias de Pocillopora acuta (Fig. S2 complementaria y resultados asociados). Estos datos confirmaron que el perfil de lípidos de los exsimbiontes era similar, tanto en términos de contenido de lípidos como de proporción de LPO, al de las células que habían sido expulsadas del coral huésped. Por último, encontramos una fuerte correlación negativa entre el contenido de lípidos y la fluorescencia de la membrana del simbiosoma (R2 = 0,37, P <0,0001, figura complementaria S3 y resultados asociados), lo que verifica que la pérdida de la relación simbiótica se correlaciona con un mayor contenido de lípidos. A partir de estos datos, estamos seguros de que las células de algas ex-simbiontes que se encuentran dentro del tejido coralino son algas en un estado post-simbiótico y en proceso de ser expulsadas de la colonia de coral.

Contrariamente a lo esperado, encontramos que bajo condiciones libres de estrés ambiental, las células de algas endosimbióticas exhibieron niveles más altos de LPO en sus cuerpos lipídicos (presentados como la proporción de lípidos peroxidados a no peroxidados) que las células exsimbiontes. Esta diferencia fue consistente en las tres especies: M. capitata (T(2) =−4,852, P = 0,040), P. compressa (T(2) = −43,391, P = 0,00053) y P. acuta (T(2 ) = −5.972, P = 0.0094) (Fig. 1c, d), lo que confirma que este patrón se conserva en una variedad de especies de coral filogenéticamente distintas. Estos datos sugieren que las células de algas endosimbióticas experimentan una mayor presión de ROS por cuerpo lipídico que las que han sido o están siendo expulsadas del huésped. A un nivel dado de presión de ROS (actividad metabólica similar o estrés), esperaríamos que una célula con reservas de lípidos más bajas se oxide más por molécula de lípido en comparación con una célula con reservas de lípidos más grandes, simplemente como resultado de una mayor cantidad de ROS a lípidos. relación, lo que puede explicar, al menos en parte, la diferencia en LPO entre el estado simbionte observado aquí. Sin embargo, al comparar la relación entre el volumen de lípidos y las proporciones de LPO dentro de los tipos de células usando modelos de mínimos cuadrados generalizados, el modelo de mejor puntaje (BIC más bajo) incluyó tanto el volumen de lípidos como el tipo de células como variables predictoras (consulte la tabla complementaria S3), lo que indica que el la relación entre el contenido de lípidos y la proporción de LPO fue diferente en los dos tipos de células, y las células endosimbióticas exhibieron una mayor LPO con un volumen de lípidos similar (Fig. S4 complementaria y resultados asociados). Con base en estos resultados, y dado que estos datos se obtuvieron en condiciones ambientales benignas, proponemos que el nivel más alto de LPO observado en los endosimbiontes no es el resultado de la producción de ROS relacionada con el estrés, sino más bien de las ROS producidas como parte del proceso metabólico general. actividad de la célula (respiración y fotosíntesis), que probablemente sería mayor en simbionte ya que la célula de alga trabaja para satisfacer la demanda metabólica de su célula huésped. Esta suposición está respaldada por nuestro trabajo previo donde se demostró que el estrés por calor reduce la capacidad fotosintética de las algas endosimbióticas en el coral duro Acropora millepora [42] y reduce la cantidad de proteínas vinculadas al metabolismo energético en los simbiontes [43]. En casos raros (~0,5 % de las células observadas), se encontró que una célula huésped contenía dos simbiontes con niveles sustancialmente diferentes de LPO; con un simbionte que tiene un perfil metabólico similar a un ex-simbionte (ver la Fig. S5c complementaria). La baja aparición de estas células de perfil LPO dual puede explicarse porque la célula huésped, al detectar un cambio en la fisiología de un simbionte, o al ser inducida por el simbionte, expulsa rápidamente a ese simbionte, lo que hace que este escenario dual sea de corta duración y, por lo tanto, desafiante. capturar. Alternativamente, puede ser que, en general, múltiples células de algas dentro de una célula huésped compartida estén más comúnmente en el mismo estado fisiológico. En este momento, sin embargo, se desconoce si el anfitrión puede expulsar selectivamente a los simbiontes individuales.

un volumen de lípidos en relación con la media de sus respectivos endosimbiontes, superpuesto con el valor medio de colonias (formas marrones). b gráfico de densidad del volumen de lípidos de todas las células endosimbióticas (área blanca) y exsimbiontes (área gris), respectivamente. c Proporción de peroxidación lipídica relativa a la media de sus respectivos endosimbiontes, superpuesta con el valor medio de colonias. d gráfico de densidad de la relación de peroxidación lipídica de todas las células endosimbióticas (área blanca) y exsimbióticas (área gris), respectivamente. e imágenes de muestra (proyección máxima de pilas de imágenes confocales) de endo- y ex-simbiontes de cada especie. La línea blanca indica un tamaño de ~10 µm. Rojo: autofluorescencia de clorofila de células de algas; amarillo: cuerpos lipídicos con baja relación LPO (verde/amarillo). Las barras de error indican 1 SE. Las estrellas indican el nivel de significación para la comparación de grupos (n = 3–5) (* P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001).

Actualmente se desconoce el papel, si es que lo hay, de la LPO en los simbiontes de coral. Se ha demostrado que la peroxidación lipídica controlada a través de enzimas como la lipoxigenasa (LOX) y la ciclooxigenasa (COX) ayuda a movilizar las reservas de lípidos en embriones y cotiledones de plantas al permitir el acceso a los lípidos de éster almacenados en los cuerpos lipídicos, liberando así ácidos grasos que pueden metabolizarse posteriormente. a través de la β-oxidación en las mitocondrias [44,45,46]. Como tal, la LPO podría facilitar la liberación de carbono de los cuerpos lipídicos para su transferencia al huésped durante la simbiosis activa. Además, se ha sugerido recientemente que las oxilipinas derivadas de simbiontes, importantes moléculas de señalización generadas a partir de la peroxidación enzimática de ácidos grasos poliinsaturados, pueden desempeñar un papel en el mantenimiento de la simbiosis coralina al desencadenar directamente cambios en la expresión génica del huésped [47]. Sin embargo, queda por investigar cualquier vínculo de este tipo con LPO en simbiontes de coral.

El análisis de conglomerados en el que se detectaron tres conglomerados, con una distribución porcentual de (endo:ex) 90:10, 34:66 y 0:100 dentro de los conglomerados 1, 2 y 3, respectivamente (verde , azul y rojo; Fig. 2). Con base en la agrupación observada, planteamos la hipótesis de que el grupo n.° 1 representa principalmente algas endosimbióticas activas y el grupo n.° 3 representa células expulsadas pero fisiológicamente activas, mientras que el grupo n.° 2 consiste en células que están muriendo (bajo contenido de lípidos y bajo LPO) o que están en el estado fisiológico intermedio que existe justo antes o después de la expulsión.

Los colores de la gráfica indican grupos identificados a través de la agrupación de Kmeans (verde: grupo 1 'endosimbiótico'; azul: grupo 2 'transición'; naranja: grupo 3 'exsimbiótico'). Las formas indican el tipo de célula (círculo: endosimbiótico, cuadrado: exsimbiótico). Los diagramas circulares muestran la proporción de células de algas endosimbióticas (endo) y exsimbióticas (ex) dentro de cada grupo; los números indican el recuento total de células de cada tipo de célula.

Para evaluar la validez de estas suposiciones, analizamos los datos obtenidos de un experimento anterior de estrés por calor en Pocillopora acuta [33]. Estos datos mostraron la misma relación entre LPO y el contenido de lípidos que se observó en el presente estudio (consulte la Fig. S6 complementaria y las estadísticas asociadas), donde el volumen total de lípidos por célula fue mayor en los exsimbiontes, mientras que las proporciones de LPO fueron significativamente más bajas, lo que confirma aún más la constancia de este patrón. Curiosamente, la LPO no aumentó con el estrés por calor, lo que respalda la hipótesis de que la diferencia en la LPO entre endosimbiontes y exsimbiontes no es causada por la producción de ROS relacionada con el estrés, al menos no en P. acuta. Usando el análisis de conglomerados en células individuales, encontramos que el estrés por calor redujo constantemente la cantidad de células endosimbióticas dentro del perfil de lípidos del conglomerado 1 (Fig. 3, consulte también la Fig. S7 complementaria para ver el gráfico de colonias replicadas individuales), lo que respalda firmemente la hipótesis de que el conglomerado 1 representa células sanas o no estresadas en simbionte. En un estudio reciente, encontramos que el estrés por calor resultó en una reducción en la proporción de proteínas clave vinculadas a la producción de energía en los simbiontes del coral Acropora milllepora [43]. Es probable que una disminución del metabolismo energético también reduzca la producción general de ROS, lo que podría explicar la reducción en la proporción de endosimbiontes LPO altos observados aquí. Estos datos también indican que los endosimbiontes sanos son metabólicamente más activos y, por lo tanto, pueden explicar la caída de la LPO cuando se pasa del estado endosimbiótico al exsimbiótico incluso sin la participación del estrés ambiental. Si bien aquí solo se probó el estrés por calor como impulsor del cambio en la LPO y el contenido de lípidos de las células endosimbióticas, la clara diferencia observada entre las células endosimbiontes y exsimbióticas en corales sanos sugiere que es probable que la respuesta sea de naturaleza general no importa la causa del cambio metabólico. Esto, sin embargo, queda por investigar. La importancia de los lípidos en la simbiosis del coral se destacó en un estudio anterior sobre el coral Euphyllia glabrescens [48], donde se demostró que el grado de acumulación de cuerpos lipídicos dentro de las células gastrodérmicas del huésped y los endosimbiontes se correlaciona con la salud aparente de la simbiosis. modulada por el estrés por calor. Nuestro estudio respalda y promueve estas observaciones al mostrar que el patrón de acumulación de lípidos en el cuerpo y LPO en endosimbiontes puede usarse como un indicador del colapso inminente de las interacciones simbióticas a nivel celular. Se desconoce la razón de la acumulación de lípidos hasta y/o después de la ruptura de la simbiosis. Sin embargo, estudios previos han demostrado que la presencia de un factor de liberación del huésped desconocido hace que las algas aumenten su producción de glicerol al desviar el exceso de carbono de los compuestos de almacenamiento [49,50,51]. Si la relación simbiótica se está rompiendo, la desaparición de este factor de liberación del huésped podría provocar que el simbionte acumule un exceso de carbono en forma de lípidos. Un estudio reciente ha sugerido que antes del colapso de la simbiosis, el aumento del suministro de nitrógeno del huésped al simbionte provoca un cambio en la prioridad metabólica del simbionte hacia el crecimiento y la división celular [52]. Con un aumento en el suministro de nitrógeno, es concebible que la disminución resultante en la relación C:N haga que el simbionte retenga un exceso de carbono que puede ser útil para el crecimiento continuo, causando un aumento en la cantidad de carbono almacenado como cuerpos lipídicos dentro del simbionte. celúla. Por otro lado, también se ha demostrado que las células de algas, incluido el Symbiodinium de vida libre, aumentan el almacenamiento de lípidos al experimentar una limitación de nitrógeno [53], lo que probablemente ocurriría después de la expulsión de la célula huésped. De cualquier manera, el aumento de cuerpos lipídicos dentro de la célula de alga parece apuntar a una pérdida del estado simbiótico y respalda las observaciones previas de un vínculo entre la simbiosis y la lipogénesis en las algas.

Las formas indican réplica de colonia. Datos sin procesar de Nielsen et al. [33]. Grupos identificados y coloreados como en la Fig. 2. Solo las células endosimbióticas están coloreadas, y las células ex-simbiontes se muestran como símbolos abiertos grises. Los gráficos de barras muestran la proporción de células endosimbióticas en cada grupo.

Con base en los hallazgos presentados, proponemos que los endosimbiontes de coral exhiben altos niveles de LPO corporal de lípidos en comparación con los simbiontes expulsados ​​​​debido a una actividad metabólica comparativamente más alta y reservas de lípidos más bajas. Contrariamente a lo esperado, la LPO no fue un indicador de estrés en las condiciones de blanqueamiento probadas, presentando otro ejemplo más de blanqueamiento de coral que ocurre independientemente del exceso de producción de ROS. Nuestros resultados sugieren que la LPO reducida junto con un aumento en las reservas de lípidos es un indicador sólido de cambios en el perfil metabólico de los endosimbiontes de coral y un indicador celular útil de la ruptura inminente de la simbiosis de coral. Al verificar este patrón en tres especies de corales lejanamente relacionadas, mostramos que estas observaciones tienen una amplia relevancia filogenética y, por lo tanto, pueden representar un marcador metabólico de aplicación general para caracterizar el estado de la simbiosis coralina. La combinación de mediciones de células individuales y análisis de conglomerados reveló un cambio pequeño pero claro en la proporción de células de un perfil metabólico específico en P. acuta que podría atribuirse al estrés por calor. Este efecto sutil se pasa por alto fácilmente en los análisis de tejidos a granel y, de hecho, no se pudo detectar en las respuestas medias de las colonias, lo que destaca la fuerza y ​​​​la importancia del trabajo de una sola célula para revelar importantes mecanismos fisiológicos de la simbiosis coral-algas. Junto con los avances recientes en las técnicas de cultivo de tejidos para cultivar y mantener células coralinas individuales simbióticas y no simbióticas [7], este nuevo marcador brinda una oportunidad emocionante para la investigación de los mecanismos subyacentes al mantenimiento y la ruptura de la simbiosis coralina.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de las figuras del manuscrito se incluyen en los materiales complementarios data.xlsx.

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Este proyecto fue apoyado por una beca PADI (28569) otorgada a KP. Los corales se recolectaron bajo los permisos de actividad especial de EE. UU. 2016-55 y 2019-23. Los autores agradecen a la difunta Prof. Ruth Gates, quien patrocinó esta investigación en el Instituto de Biología Marina de Hawái (HIMB).

Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Tecnología de Sydney, Ultimo, NSW, Australia

Daniel Aagren Nielsen y Katherina Petrou

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Conceptualización, metodología, investigación: DAN, KP; análisis formal, visualización, redacción—preparación del borrador original: DAN; Redacción—revisión y edición: DAN, KP; adquisición de fondos, recursos: KP.

Correspondencia a Daniel Aagren Nielsen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Nielsen, DA, Petrou, K. Las reservas de lípidos revelan el estado de la simbiosis de coral y algas a nivel unicelular. ISME COMÚN. 3, 29 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00234-8

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Recibido: 30 noviembre 2022

Revisado: 14 de marzo de 2023

Aceptado: 22 de marzo de 2023

Publicado: 04 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00234-8

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