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Oct 14, 2023

Los niveles actuales de contaminación por microplásticos afectan los microbiomas intestinales de las aves marinas salvajes

Naturaleza Ecología y Evolución

Nature Ecology & Evolution volumen 7, páginas 698–706 (2023) Citar este artículo

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Los microplásticos contaminan los entornos de todo el mundo y son ingeridos por numerosas especies, cuya salud se ve afectada de múltiples formas. Una dimensión clave de la salud que puede verse afectada es el microbioma intestinal, pero estos efectos están relativamente inexplorados. Aquí, investigamos si los microplásticos están asociados con cambios en los microbiomas proventriculares y cloacales en dos especies de aves marinas que ingieren microplásticos de manera crónica: los fulmares del norte y las pardelas cenicientas. La cantidad de microplásticos en el intestino se correlacionó significativamente con la diversidad y composición microbiana intestinal: los microplásticos se asociaron con disminuciones en la microbiota comensal y aumentos en patógenos (zoonóticos) y microbios resistentes a los antibióticos y que degradan el plástico. Estos resultados ilustran que las concentraciones y mezclas de microplásticos ambientalmente relevantes están asociadas con cambios en los microbiomas intestinales en las aves marinas salvajes.

Los microplásticos representan una amenaza emergente para la vida silvestre y la salud humana1,2. Estas pequeñas partículas de plástico (<5 mm) contaminan los cuerpos de agua, los suelos y el aire1,3. La omnipresencia de los microplásticos ha fomentado una amplia investigación destinada a determinar los posibles efectos negativos para la salud de los animales expuestos, incluidos los humanos1,3. La investigación ha demostrado que los microplásticos pueden afectar negativamente a los animales y su salud3. A pesar de este trabajo, nuestra comprensión de los efectos de la ingestión de microplásticos en las comunidades de microbiomas intestinales es deficiente.

El microbioma es la colección de microbios en un área determinada del cuerpo que ha formado una relación simbiótica evolutiva con su especie huésped4. Por lo tanto, los microbiomas son esenciales para la nutrición, la fisiología, la función inmunitaria, el desarrollo e incluso el comportamiento del huésped, y muchas enfermedades se han asociado con microbiomas intestinales alterados5. Los microbiomas pueden cambiar en diversidad taxonómica y funcional en animales sujetos a factores estresantes antropogénicos como la contaminación ambiental6,7. En esta línea, estudios de laboratorio revelaron que los microplásticos pueden causar cambios en los microbiomas intestinales con implicaciones negativas para la salud8,9,10. Sin embargo, como un campo en su infancia, los efectos de los microplásticos en las poblaciones silvestres aún se desconocen. Teniendo en cuenta que se espera que los niveles de contaminación por microplásticos aumenten y se acumulen con el tiempo11, es imperativo comprender cómo se ve afectada la salud de la vida silvestre, reflejada en el microbioma intestinal.

En este artículo, estudiamos la respuesta microbiana intestinal a diversos grados de ingestión de microplásticos, cuantificados mediante el conteo y pesaje de microplásticos, en dos especies de aves marinas diferentes: la pardela cenicienta (Calonectris borealis), n = 58 individuos, recolectados en el archipiélago de las Azores en Portugal y fulmares del norte (Fulmarus glacialis), n = 27 individuos, recolectados en Baffin Bay, Canadá. Sus distribuciones abarcan ambos hemisferios (Datos extendidos Fig. 1). Ambas especies ingieren desechos plásticos, y en particular el fulmar se establece como un bioindicador de plásticos12,13,14,15. Al extender el enfoque únicamente del microbioma intestinal (que en las aves generalmente se determina tomando muestras de la cloaca) para incluir también el microbioma del proventrículo, nuestro objetivo fue determinar si la ingestión de microplásticos tiene consecuencias similares en los microbiomas del tracto gastrointestinal (TGI). ) a medida que avanza a lo largo del tracto digestivo. Mediante la secuenciación del gen del ARN ribosómico 16S, encontramos que los filos más abundantes en el conjunto de datos eran Proteobacteria (49,9 %), Firmicutes (33,1 %), Actinobacteriota (6,2 %), Fusobacteriota (4,2 %) y Bacteroidota (3,7 %; datos extendidos Fig. . 2), que representó más del 97% de las 4.602.578 lecturas.

Usando modelos mixtos lineales y teniendo en cuenta otras variables biológicas y experimentales (Resultados complementarios), probamos si la diversidad microbiana alfa (número observado de variantes de secuencia de amplicón (ASV), índice de Shannon, diversidad filogenética de Faith (PD) y métrica H de Allen) de proventricular y microbiomas cloacales en las dos especies se asoció con microplásticos (recuentos y masa; resultados complementarios) y, al incluir términos de interacción, si los efectos de los microplásticos fueron similares entre las especies de aves marinas y en todo el GIT. Para todas las métricas de diversidad alfa, el recuento de microplásticos se correlacionó positivamente con la diversidad microbiana alfa en el proventrículo (número observado de ASV: β = 0,67, t81 = 2,96, P = 0,004; índice de Shannon: β = 0,27, t81 = 2,85, P = 0.006; PD de Faith: β = 1.68, t81 = 3.46, P < 0.001; Métrica H de Allen: β = 0.07, t81 = 2.73, P = 0.007; Fig. 1, Datos extendidos Fig. 3 y Tabla complementaria 1). Estas asociaciones fueron significativamente mayores en el proventrículo que en la cloaca (número observado de ASV: P = 0,011; PD de Faith: P = 0,001; con una tendencia para el índice de Shannon: P = 0,084 y la métrica H de Allen: P = 0,089), donde el efecto fue cercano a cero (número observado de ASV: β = 0,01; índice de Shannon: β = 0,08; PD de Faith: β = −0,06; métrica H de Allen: β = 0,02).

a–f, Cada punto representa una muestra de microbioma que está coloreada por la ubicación dentro del GIT, ya sea del microbioma proventricular (puntos azules, n = 85) o cloacal (puntos naranjas, n = 84). Métricas de diversidad alfa: número observado de ASV (tenga en cuenta que la escala no es lineal debido a la transformación de la raíz cuadrada de los valores de diversidad alfa) (a y b), índice de Shannon (c y d) y PD de Faith (e y f) se trazan en relación con la proporción de conteos de MP (conteo de MP/masa de ave individual; izquierda) y la proporción de masa de MP (masa de MP/masa de ave individual; derecha). Las líneas en cada gráfico denotan los valores predichos basados ​​en el modelo mixto lineal para esa métrica de diversidad alfa, y las áreas sombreadas que flanquean las líneas indican los intervalos de confianza del 95 % superior e inferior.

En relación con la masa de microplásticos, las aves con mayor masa de microplásticos tuvieron índice de Shannon significativamente menor (β = −0,20, t81 = −2,38, P = 0,020), PD de Faith (β = −1,12, t81 = −2,47, P = 0,016) y la métrica H de Allen (β = −0,06, t81 = −2,54, P = 0,013) y una tendencia de correlación negativa con el número observado de ASV (β = −0,40, t81 = −1,95, P = 0,055) en el microbioma proventricular ( Fig. 1 y Tabla Suplementaria 1). Estas asociaciones difirieron significativamente entre el microbioma proventricular y cloacal al considerar la PD de Faith (P = 0,006) y la métrica H de Allen (P = 0,020), y mostraron una tendencia para el número observado de ASV (P = 0,073) y el índice de Shannon (P = 0,073). 0,090). En la cloaca, la asociación con el PD de Faith cloacal fue, en contraste con el proventrículo, positiva (β = 0,36), mientras que fue cercana a cero para el número observado de ASV (β = 0,05), índice de Shannon (β = −0,02 ) y la métrica H de Allen (β = 0,01). La eliminación de muestras que podrían considerarse valores atípicos (menos del primer percentil o más del percentil 99) no cambió sustancialmente los resultados (Tabla complementaria 2). Del mismo modo, los modelos que utilizan el recuento o la masa de microplásticos sin estandarizar por la masa de las aves tampoco cambiaron sustancialmente los resultados (Tabla complementaria 3).

En general, tanto el recuento como la masa de microplásticos se correlacionaron significativamente (positiva y negativamente, respectivamente) con la diversidad alfa, con mayores correlaciones anteriormente (proventrículo) que posteriormente (cloaca), lo que sugiere que los efectos de los microplásticos en la diversidad microbiana alfa disminuyen a medida que viajan a través de la GIT. Si los microplásticos actúan como vectores de microbios patógenos y/o extraños2,16, entonces este modo de acción podría disminuir a lo largo del TGI a medida que los microbios que viajan a dedo entren en contacto y compitan con más microbios residentes y tengan que sobrevivir acumulando las defensas inmunitarias del huésped17. Además, aunque el papel de los microplásticos como vectores de sustancias químicas orgánicas hidrofóbicas sigue sin estar claro18, estudios recientes han demostrado que su desorción en microplásticos disminuye exponencialmente con el tiempo en soluciones de intestino artificial19 y son más altas a temperaturas más altas y pH más bajo (ref. 20), que, en menos en pollos—más bajo en el proventrículo21.

La observación de que la DP de Faith explicó la mayor cantidad de variación (resultados complementarios) y se vio más afectada por los microplásticos respaldó aún más la conclusión de que los microplásticos podrían actuar como vectores microbianos. Esto sugiere que los microplásticos pueden introducir no solo una mayor cantidad de microbios en los microbiomas GIT (reflejado por la riqueza que también aumentó), sino también una mayor diversidad de microbios de diferentes linajes evolutivos. En particular, la forma en que se midió la cantidad de microplásticos reveló diferentes impactos potenciales de los microplásticos en el microbioma GIT. Si bien el recuento de microplásticos generalmente se asoció positivamente con la diversidad alfa, la masa microplástica generalmente se asoció negativamente. Aunque el recuento de microplásticos podría aumentar la diversidad alfa al actuar como vectores2,16, la masa de microplásticos tiene en cuenta el volumen y la densidad, la última de las cuales puede verse influenciada por el tipo y las propiedades del polímero22. Por lo tanto, la masa probablemente refleja más las diferencias en las propiedades de los polímeros que el recuento. Dado que se pueden agregar aditivos antimicrobianos a los polímeros plásticos22, un aumento en la masa de dicho polímero podría disminuir la diversidad microbiana alfa. Analizar estas diferencias requeriría más conocimiento sobre los tipos de polímeros microplásticos y sus aditivos, y parece una vía fértil para futuras investigaciones.

La selección del modelo no apoyó la interacción entre los microplásticos (recuento y masa) y las especies de aves marinas anfitrionas (Métodos); por lo tanto, cualquier correlación entre los microplásticos y la diversidad alfa microbiana intestinal fue similar entre los fulmares del norte y las pardelas cenicientas. Esto sugiere que los efectos observados en este estudio pueden aplicarse ampliamente en Procellariiformes que ingieren microplásticos.

A continuación, investigamos si los microplásticos se correlacionaban con la composición microbiana del GIT entre individuos (diversidad beta) y si estas correlaciones eran similares entre las especies de aves marinas y en todo el GIT. Hicimos esto usando pruebas de permutación implementadas en vegan::adonis con 9,999 permutaciones (Resultados complementarios)23. Con fines de visualización, los resultados de los microplásticos se trazaron en gráficos de análisis de coordenadas principales (PCoA) (datos extendidos, figuras 4 a 8), que solo pueden representar dos dimensiones a la vez, mientras que estos resultados estadísticos se evaluaron en todas las dimensiones del matrices de diversidad beta. Al considerar el conteo de microplásticos, encontramos que el conteo está significativamente correlacionado con la diversidad beta al usar distancias UniFrac ponderadas (P < 0.001) y no ponderadas (P < 0.001), así como distancias euclidianas dentro del enfoque de relación logarítmica de Aitchison para datos de composición (P < 0.001; Datos extendidos Fig. 4 y Tabla complementaria 4). Sin embargo, esto dependía no solo de la ubicación del microbioma dentro del TGI (UniFrac ponderado: P = 0,008; UniFrac no ponderado: P < 0,001; Aitchison: p = 0,001; Datos extendidos Fig. 5), sino también de las especies de aves marinas hospedadoras (UniFrac ponderado: P < 0,001; UniFrac p = 0,043, UniFrac no ponderado: p < 0,001, Aitchison: P < 0,001, Datos ampliados Fig. 6 y Tabla complementaria 4). Esto significa que el recuento de microplásticos tiene diferentes asociaciones con la diversidad beta en el proventrículo versus la cloaca, y entre las especies.

Pasando del conteo de microplásticos a la masa, encontramos que la masa está significativamente correlacionada con la diversidad beta cuando se usan distancias UniFrac no ponderadas (P < 0.001) y el enfoque de Aitchison (P < 0.001) y una tendencia cuando se usan distancias UniFrac ponderadas (P = 0.069; datos extendidos Figura 4). Esto dependía de la ubicación del microbioma dentro del TGI al considerar las distancias UniFrac ponderadas (P = 0,016; datos extendidos Fig. 7a,b) y el enfoque de Aitchison (P = 0,011; datos extendidos Fig. 7e,f), así como el anfitrión especies que se están investigando (UniFrac ponderado: P <0.001; UniFrac no ponderado: P <0.001; Aitchison: P <0.001; Datos extendidos Fig. 8 y Tabla complementaria 4). En consecuencia, la masa microplástica se asoció con la composición microbiana del proventrículo y la cloaca de manera diferente solo cuando se consideraron las distancias UniFrac ponderadas y el enfoque de Aitchison, pero no las distancias UniFrac no ponderadas. Además, esta asociación dependía de la especie huésped en cuestión. Los resultados de los modelos que utilizan el recuento o la masa de microplásticos sin estandarizar por la masa de las aves mostraron resultados similares (Tabla complementaria 5). Dado que las especies huésped que investigamos se recolectaron en lugares distantes, pertenecen a diferentes géneros y representaban diferentes grupos de edad (adultos versus polluelos), no fue sorprendente que la composición de su microbioma GIT difiriera24, lo que significa que los taxones microbianos disponibles para cambiar podrían no ser los mismo. Se necesitarán estudios futuros para desentrañar los roles de la filogenia, la edad y la ubicación geográfica del huésped en la modulación de los efectos de los microplásticos en los microbiomas intestinales de la vida silvestre.

Para comprender qué taxones podrían estar impulsando las asociaciones entre los microplásticos y la diversidad beta microbiana, realizamos una prueba ANCOM25, que determinó que 17 ASV eran diferencialmente abundantes (Fig. 2 y resultados complementarios). De estos, diez se asociaron con el recuento de microplásticos (Fig. 2a) y cinco se asociaron con la masa microplástica (Fig. 2b). Los géneros Catellicoccus, Cetobacterium y Pseudoalteromonas se asociaron tanto con el recuento microplástico como con la masa microplástica. En particular, a medida que aumentó el recuento de microplásticos, disminuyó la abundancia de microbiota residente asociada con huéspedes sanos, mientras que aumentó la abundancia de microbios que se sabe que están involucrados en enfermedades, resistencia a los antibióticos y degradación de plásticos y aquellos considerados patógenos zoonóticos. Por ejemplo, Pseudoalteromonas, que comprende bacterias marinas generalmente asociadas con organismos sanos26, se asoció negativamente con el recuento de microplásticos, al igual que miembros conocidos de la microbiota de aves (marinas), como Psychrobacter26,27, Enterococcus28,29, Catellicoccus30,31 y Staphylococcus32,33 . Por el contrario, Corynebacterium xerosis se asoció positivamente con el recuento de microplásticos y se identificó como un patógeno emergente con potencial para volverse zoonótico34,35, y su género ha mostrado capacidades de degradación de plásticos (base de datos en la referencia 36). Además, aunque Lactobacillus aviarius es un miembro común en la microbiota aviar37, una mayor abundancia es indicativa de un desarrollo deficiente en las aves29. Se correlacionaron positivamente con el recuento de microplásticos Parvimonas, un predictor de cáncer colorrectal en humanos38, y Cetobacterium, que es resistente al antibiótico vancomicina39. Clostridium perfringens, que tuvo la mayor asociación positiva con la masa microplástica y una mayor asociación con el microbioma cloacal versus proventricular, es un patógeno en pollos que produce toxinas extracelulares que pueden causar enteritis necrótica aviar, así como gangrena gaseosa potencialmente mortal e intoxicación alimentaria en pollos. humanos40. Otros patógenos potenciales asociados a la masa microplástica fueron Fusobacterium41 y Edwardsiella42,43.

a–e, cada punto representa un ASV trazado por su asignación taxonómica en el eje y y en orden decreciente de su coeficiente de relación logarítmica (clr) centrado en el eje x. Por lo tanto, los puntos a la derecha del centro cero muestran una correlación positiva con los microplásticos, mientras que los puntos a la izquierda muestran una correlación negativa. ANCOM identificó los ASV representados como diferencialmente abundantes (en w0 = 0,70) según el recuento de microplásticos (a), la masa de microplásticos (b), la interacción entre el recuento de microplásticos y el tipo de muestra (los puntos azules representan el proventrículo, los puntos rojos representan la cloaca) (c), la interacción entre la masa microplástica y el tipo de muestra (los puntos azules representan el proventrículo, los puntos naranjas representan la cloaca) (d) y la interacción entre los recuentos de microplásticos y las especies (los puntos verdes representan las pardelas de Cory, los puntos morados representan los fulmares del norte) ( mi). ANCOM identificó 17 ASV diferencialmente abundantes; sin embargo, aquí se muestran 21 puntos porque 3 de los 17 ASV están asociados con recuentos de microplásticos (a) así como con masa microplástica (b; anotados como Catellicoccus sp., Cetobacterium sp. y Pseudoalteromonas sp.) y un ASV está asociado con ambos masa microplástica (b) y la interacción entre los recuentos de microplásticos y el tipo de muestra (c; anotado como Edwardsiella sp.).

Los géneros Cetobacterium y Fusobacterium también se asociaron con la ingestión de plástico en tortugas bobas (Caretta caretta) en cautiverio rescatadas del mar Adriático noroccidental44. Esto sugiere que los microplásticos pueden tener impactos similares en las comunidades microbianas intestinales, no solo entre especies estrechamente relacionadas, como las aves marinas de nuestro estudio, sino también entre especies más distantes que habitan en entornos similares.

De los 17 ASV diferencialmente abundantes en total, 3 se asociaron negativamente con la interacción entre el recuento de microplásticos y la ubicación GIT (Fig. 2c; Flaviflexus, Edwardsiella y Corynebacterium). Dos ASV se asociaron con la interacción entre la masa microplástica y la ubicación del GIT: Clostridium perfringens, que se correlacionó positivamente, y Acinetobacter, que se correlacionó negativamente (Fig. 2d). Para ambos ASV, la magnitud de la correlación fue mayor en el microbioma cloacal que en el proventricular. ANCOM reveló que un ASV perteneciente al género Catellicoccus se asoció negativamente con la interacción entre el recuento de microplásticos y las especies de aves marinas anfitrionas, pero ningún ASV se asoció con la interacción entre la masa microplástica y las especies anfitrionas (Fig. 2e).

Exploramos si los efectos de los microplásticos estaban vinculados a la condición corporal del huésped utilizando el índice de masa escalado calculado utilizando la longitud del tarso individual y la masa corporal. Sin embargo, los únicos predictores significativos de la condición corporal fueron la especie huésped (β = −0.76, t = -3.98, p =< 0.001) y la interacción entre especies y el recuento de microplásticos (β = −0.94, t = −3.62, P ≤ 0.001 ), pero no solo el recuento de microplásticos (Tabla complementaria 6). Por lo tanto, nuestra medición de la condición corporal no captó ningún efecto que los microplásticos puedan tener en la salud del huésped. Además, la condición corporal no fue un predictor significativo en ningún modelo de diversidad alfa (Tabla complementaria 7). En nuestros modelos de diversidad beta, la condición corporal predijo significativamente las distancias UniFrac no ponderadas (P = 0.007) y Aitchison (P < 0.001; Tabla complementaria 8). Por lo tanto, aunque los microplásticos están relacionados con aspectos de la composición microbiana, el mecanismo por el cual los microplásticos podrían causar cambios microbianos no parece estar relacionado con la condición corporal.

En resumen, encontramos que los microplásticos ingeridos se correlacionaron con la diversidad y composición microbiana en los TGI de las aves marinas. Las asociaciones entre los microplásticos y la diversidad alfa no dependieron de las especies de aves marinas anfitrionas, mientras que sus correlaciones con la diversidad beta fueron específicas de la especie anfitriona. Los microplásticos se correlacionaron más con los microbiomas proventriculares que con los cloacales. Además, un aumento de microplásticos se asoció con una disminución de la microbiota comensal y un aumento de patógenos (zoonóticos) y microbios resistentes a los antibióticos y degradadores de plástico. Aunque observamos que estos resultados se obtuvieron a partir de la secuenciación del gen 16S rRNA, que tiene limitaciones en términos de alcanzar la identidad taxonómica a nivel de cepa e identificar funciones microbianas, nuestro estudio respalda las predicciones anteriores de que la ingestión crónica de microplásticos está asociada con la disbiosis intestinal2.

Nuestro estudio ilustra que las concentraciones y mezclas de microplásticos ambientalmente relevantes se correlacionan con la diversidad microbiana intestinal, lo que destaca el potencial de disbiosis intestinal en aves marinas silvestres que viven en lugares remotos con rutas de migración a gran escala y que se sabe que ingieren desechos de microplásticos en la naturaleza12,13,14. Los fulmares del norte son bioindicadores bien conocidos de la contaminación por microplásticos45. Nuestros resultados proporcionan la base sobre la cual la investigación futura puede examinar los impactos negativos acumulativos de los microplásticos debido a la exposición crónica, especialmente considerando que los microplásticos pueden retenerse durante semanas o meses en Procellariiformes y, por lo tanto, es poco probable que dependan por completo de la última comida46. Las implicaciones son de gran alcance: por un lado, los humanos también están expuestos a micro (y nano) plásticos47,48,49, lo que plantea la pregunta de cómo los humanos y su salud (intestinal) podrían verse afectados por la ingestión de plástico. Por otro lado, el microbioma intestinal juega un papel central en la salud del huésped, y a medida que las zoonosis y el estado de salud de la vida silvestre en un mundo globalizado ganan más atención50, la búsqueda de causas y orígenes de posibles zoonosis futuras está ganando importancia.

Este estudio se realizó en el marco de dos proyectos en curso que, respectivamente, monitorean la pardela cenicienta (C. borealis) en el borde del giro subtropical del Atlántico Norte en el archipiélago de las Azores (Portugal) y los fulmares norteños (F. glacialis) cerca de Qikiqtarjuaq, Nunavut en el Atlántico Noroccidental (Datos ampliados Fig. 1; BirdLife International51). Ambas especies pertenecen a la familia Procellariidae, se alimentan en la superficie e ingieren desechos microplásticos12,13,14,52,53. Se realizaron recolecciones de fulmares del norte durante la temporada de reproducción entre julio y agosto de 2018. Se disparó un total de 27 fulmares del norte adultos fuera de los sitios de reproducción13. Las recolecciones de pardelas cenicientas se realizaron durante la temporada de despegue, cuando se sabe que los polluelos chocan con edificios y otras estructuras hechas por el hombre cuando abandonan el nido, a menudo debido a la sensibilidad a la contaminación lumínica nocturna artificial, que puede provocar la muerte. Luego se recolectaron cadáveres de volantones frescos cerca de las colonias en las Azores entre octubre y noviembre de 2017 y 2018. Las aves se congelaron a -20 °C hasta el momento de la disección y el muestreo del microbioma, lo que llevó a un total de 58 volantones recolectados.

Las aves marinas recolectadas fueron diseccionadas y muestreadas en condiciones estériles siguiendo un protocolo estandarizado15,54. Además de este protocolo, se usaron hisopos estériles para tomar muestras del proventrículo y la cloaca de cada ave individual (con la excepción de un individuo de fulmar norteño, que por error se tomó una muestra solo una vez en el proventrículo). Cada hisopo se colocó en tampón de conservación de ácidos nucleicos55 y se mantuvo a -20 °C hasta la extracción del ADN. Se recolectaron desechos plásticos recolectados del GIT sobre un tamiz de 1 mm, se examinaron bajo un microscopio óptico y se caracterizaron siguiendo los protocolos descritos en la ref. 56. Por brevedad, nos referimos a estos desechos plásticos como microplásticos, aunque no todas las piezas medidas fueron menores de 5 mm (Rodríguez et al., en preparación)13. Por lo tanto, para cada uno de los 85 individuos de aves marinas, recolectamos datos sobre la masa corporal y la longitud del tarso del individuo, el número y la masa total de microplásticos en su TGI (usando una balanza con una precisión de ±0,0001 g) y su proventricular. (n = 85) y microbioma cloacal (n = 84).

El ADN de hisopos completos se extrajo utilizando el kit de extracción NucleoSpin 'DNA from soil' de Macherey-Nagel (Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. Se incorporó un paso adicional de batido de perlas en el protocolo para lisar mecánicamente las células bacterianas6. A lo largo de este paso se incluyeron 16 blancos de extracción que contenían únicamente los reactivos de extracción y posteriormente se secuenciaron para poder identificar y eliminar posibles contaminaciones.

Después de la extracción de ADN, nos dirigimos a la región hipervariable V4 del gen 16S rRNA usando los cebadores bacterianos 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) y 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) (ref. 57), a los que agregamos adaptadores de cebador directo (CS1-515F) y de cebador inverso (CS2-806R) para poder utilizar la química de secuenciación Fluidigm (Access Array System for Illumina Sequencing Systems, Fluidigm Corporation). Amplificamos esta región objetivo en dos pasos de la cadena de reacción de la polimerasa (PCR de dos pasos; información complementaria), asegurándonos de incluir espacios en blanco de PCR que comprendan solo los reactivos de PCR a lo largo de este proceso. En el primer paso, se administró un volumen total de PCR de 10 µl compuesto por 1 µl de ADN extraído (5–10 ng), 1,5 µl (200 nM) de cebadores directos e inversos agrupados, 5 µl de AmpliTaq Gold 360 Master Mix y 2,5 µl de dH2O ultrapura. ejecutar bajo las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min; 40 ciclos que incluyen desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 60 °C durante 30 s y elongación a 72 °C durante 45 s; elongación final a 72 °C durante 7 min. Se realizó electroforesis en gel para cada muestra para asegurar el éxito de la PCR. El segundo paso de PCR consistió en un volumen de PCR de 20 µl que incluía 2 µl de ADN amplificado del primer paso de PCR, 4 µl (400 nM) de cebadores de códigos de barras directos e inversos agrupados, 10 µl de AmpliTaq Gold 360 Master y 4 µl de dH2O ultrapura, que se ejecutar bajo las mismas condiciones de PCR como se describió anteriormente en diez ciclos. Las muestras con código de barras se purificaron con perlas (proporción 1:1), se cuantificaron y se agruparon a 8 nM. Secuenciamos por pares un total de 169 muestras de hisopos, 16 espacios en blanco de extracción y 5 espacios en blanco de PCR en una sola ejecución utilizando nuestra propia plataforma de secuenciación interna Illumina MiSeq en el Instituto de Ecología Evolutiva y Genómica de la Conservación de la Universidad de Ulm, Alemania.

Las lecturas resultantes de la secuenciación de amplicones de Illumina MiSeq se procesaron en QIIME 2 (versión 2020.8.0) con el complemento DADA2 para generar ASV58,59. La taxonomía se asignó con la función classify-sklearn de QIIME 2 (y su configuración de valor de confianza predeterminada) utilizando el clasificador SILVA (versión 138) entrenado con nuestros cebadores objetivo60. Se eliminaron los ASV no asignados a bacterias a nivel de dominio junto con los identificados como cloroplastos o secuencias mitocondriales. Construimos un árbol filogenético enraizado como se describe en la ref. 6. El árbol filogenético, la taxonomía y las tablas ASV junto con los metadatos de muestra se importaron a R (versión 3.6.1) (ref. 61) para crear un objeto phlyoseq usando el paquete phyloseq (versión 1.28.0) (ref. 62) para análisis posteriores.

En R, primero exploramos los espacios en blanco de extracción y PCR que contenían 185 de un total de 2956 ASV. De estos 185 ASV, 93 eran exclusivos de los espacios en blanco y posteriormente se eliminaron. Utilizando el paquete de descontaminación (versión 1.4.0) (ref. 63) con su identificación de contaminantes basada en la prevalencia y el umbral predeterminado de 0,1, se identificaron y eliminaron 18 ASV adicionales como posibles contaminantes. Luego, consideramos que las muestras con una profundidad de secuenciación de menos de 2900 lecturas habían fallado y las eliminamos junto con cualquier ASV único para ellas del conjunto de datos. Además, aplicamos un filtro de prevalencia del 2% y un filtro de abundancia de diez lecturas en todo el conjunto de datos para eliminar ASV muy raros que probablemente sean artefactos de secuenciación. Esto eliminó 254 ASV del conjunto de datos y eliminó todos los ASV de los espacios en blanco de extracción y PCR. Después del filtrado, nuestro conjunto de datos consistió en 4 602 578 lecturas en 2517 ASV y 169 muestras, lo que resultó en una profundidad de secuenciación promedio de 27 234 ± 5999 lecturas por muestra.

Para reflejar mejor los efectos que los microplásticos pueden tener en cada individuo, expresamos el conteo y la masa de microplásticos como proporciones de la masa de cada ave individual al dividir el conteo y la masa de microplásticos de cada individuo por su masa corporal, aunque también presentamos los resultados de usar solo el conteo de microplásticos o masa, sin estandarizar por masa de ave. Utilizamos estas variables a lo largo del análisis, aunque por brevedad nos referimos a ellas como recuento de microplásticos y masa de microplásticos.

Primero calculamos la diversidad microbiana intraindividual (diversidad alfa) usando las siguientes métricas y paquetes: Faith's PD, que refleja PD, (paquete btools, versión 0.0.1) (ref. 64); índice de Shannon (loge), que tiene en cuenta tanto la riqueza microbiana como la uniformidad; el número observado de ASV, que refleja la riqueza (los dos últimos usando el paquete phyloseq); y H métrica de Allen65,66. Luego, utilizando modelos de efectos mixtos lineales del paquete nlme (versión 3.1.141) (ref. 67), modelamos cada métrica de diversidad alfa en función de lo siguiente: la interacción entre el recuento de microplásticos (a escala) y la ubicación GIT (ya sea proventrículo o cloaca); la interacción entre la masa microplástica (escalada) y la ubicación del GIT; especies de aves marinas anfitrionas; y profundidad de secuenciación (a escala). Inicialmente incluimos la interacción entre los recuentos de microplásticos (a escala) y las especies de aves marinas anfitrionas más la interacción entre la masa de microplásticos (a escala) y las especies de aves marinas anfitrionas para probar si los efectos de los microplásticos en el microbioma intestinal son específicos de la especie anfitriona. Sin embargo, los modelos con estas dos interacciones no solo tuvieron un peor ajuste que aquellos sin las interacciones (usando el criterio de información de Akaike (AIC), ΔAIC >2), ni la interacción fue estadísticamente significativa (P < 0.05), independientemente de la métrica de diversidad alfa . Por lo tanto, eliminamos estas dos interacciones de nuestros modelos finales, mantuvimos las especies de aves hospedantes solo como un factor explicativo y concluimos que cualquier efecto de los microplásticos en la diversidad alfa microbiana intestinal fue similar entre fulmares y pardelas, y no específico para ninguna de las especies. Además, tomamos en cuenta la falta de independencia debido al muestreo repetido del mismo individuo en diferentes puntos del GIT (proventrículo y cloaca) al establecer la ID de ave individual como un factor aleatorio (intersección aleatoria). El mejor ajuste del modelo se obtuvo transformando la raíz cuadrada del número observado de ASV y la métrica H de Allen68. Las dos métricas de diversidad alfa restantes no se transformaron. Tomamos en cuenta las diferentes variaciones en la diversidad alfa entre las muestras de microbioma proventricular y cloacal, junto con las diferencias en la variación según la profundidad de secuenciación al agregar una estructura de variación varComb a los modelos, siguiendo el protocolo descrito en la ref. 68. Verificamos la multicolinealidad entre las variables explicativas utilizando factores de inflación de varianza del paquete de automóvil (versión 3.0.3) (ref. 69), que no reveló ninguna variable problemática70. Los valores R2 marginales (R2LMM(m)) y condicionales (R2LMM(c))71 para cada modelo se calcularon utilizando el paquete piecewise SEM (versión 2.1.0) (ref. 72).

Para analizar la composición de la comunidad microbiana GIT en ambas especies de aves marinas, generamos matrices de distancia usando la función phyloseq::distance basada en distancias UniFrac ponderadas y no ponderadas, ya que estas fueron desarrolladas específicamente para datos de microbiomas73. Además, aplicamos el enfoque de relación logarítmica de Aitchison para datos de composición74, que consiste en transformar logarítmicamente en el centro de la tabla ASV después de agregar un pseudoconteo de uno y generar una matriz de distancia utilizando distancias euclidianas. Luego probamos los efectos de los microplásticos en la composición microbiana usando pruebas de hipótesis nulas con la prueba de permutación implementada en la función vegan::adonis (versión 2.5-5) (ref. 23). Definimos un modelo por matriz de distancia (UniFrac ponderado y no ponderado, Aitchison) y usamos la misma fórmula de modelo que se describe en la sección anterior, con la ID de ave individual establecida dentro del argumento 'strata'. Para visualizar los resultados de los datos multidimensionales, utilizamos técnicas de ordenación sin restricciones PCoA para matrices UniFrac ponderadas y no ponderadas y análisis de componentes principales para el enfoque de Aitchison utilizando la función phyloseq::ordinate. Para representar visualmente los efectos de nuestras variables discretas y continuas de microplásticos (recuento y masa), las ajustamos como vectores en nuestras gráficas de ordenación usando la función vegan::envfit basada en los dos primeros ejes de ordenación.

Para determinar qué taxones microbianos podrían estar impulsando las diferencias asociadas a los microplásticos en la diversidad beta, realizamos una prueba de análisis de composición de microbiomas (ANCOM)25. Al agregar la funcionalidad del modelo de efectos mixtos lineales del paquete nlme, usamos la misma fórmula del modelo que se describió anteriormente para determinar qué ASV estaban asociados con el recuento y la masa de microplásticos, con la interacción entre los microplásticos y la ubicación del GIT, y con la interacción entre los microplásticos y el huésped. especies de aves marinas. Debido a que la inflación cero es un sello distintivo de los datos del microbioma que puede conducir a tasas de descubrimiento falsas en este tipo de análisis25, aplicamos un filtro adicional para mantener solo los ASV que estaban presentes en al menos 15 muestras. Esto redujo el número total de ASV a 81. Luego ejecutamos ANCOM con un nivel de significación de 0,05, seleccionamos un parámetro de corrección moderado para aplicar el procedimiento de Benjamini-Hochberg que corrige pruebas múltiples25 y usamos el valor de corte predeterminado w0 = 0,70 de modo que solo los ASV para los que se rechazó la hipótesis nula a una tasa del 70% o más se determinaron como diferencialmente abundantes. Para trazar los ASV diferencialmente abundantes y mostrar qué ASV se correlacionaron positiva o negativamente con los microplásticos, adaptamos el código del complemento QIIME 2 q2-composition59 para que el análisis de datos de composición se ejecute en R y calculamos las estimaciones de los parámetros del modelo a partir de la ejecución del modelo mixto lineal. en la proporción de cada par de ASV en la tabla de ASV transformada (clr) de proporción logarítmica centrada25.

Para explorar los vínculos entre la condición corporal del huésped, la ingestión de microplásticos y los microbiomas intestinales del huésped, calculamos la condición corporal por ave marina utilizando el índice de masa escalado con la longitud del tarso individual como medida corporal lineal75. Luego, utilizamos un modelo lineal generalizado con una distribución logarítmica gamma y la condición corporal como variable de respuesta explicada por el conteo y la masa de microplásticos, junto con sus interacciones con el sexo y la especie huésped. Luego, incluimos la condición corporal del huésped como una variable explicativa en nuestros modelos de diversidad alfa y beta descritos anteriormente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación y los metadatos correspondientes están disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica con el número de acceso PRJNA930758. Además, los metadatos también se almacenan en GitHub (https://github.com/gfackelmann/Current-levels-of-microplastic-pollution-impact-wild-seabird-gut-microbiomes).

Los scripts para nuestro análisis se almacenan en GitHub (https://github.com/gfackelmann/Current-levels-of-microplastic-pollution-impact-wild-seabird-gut-microbiomes).

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Los fulmares del norte se recolectaron con permisos de cuidado de animales (Permiso del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Acadia 02-18), permisos federales para trabajar con aves marinas y en Áreas Nacionales de Vida Silvestre (ECCC NUN-NWA-18-02 y NUN-SCI-18-02), y permisos territoriales (GN-WL-2018-004, NIRB-17YN069 y NPC-148645). Las pardelas cenicientas se recolectaron en el marco de la Campaña SOS Cagarro organizada por la Dirección Regional de Políticas Marinas y la Dirección Regional de Medio Ambiente y Cambio Climático del Gobierno de las Azores. Okeanos recibió fondos nacionales a través de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FCT) y el Instituto Público (IP), en el marco del proyecto UIDB/05634/2020 y UIDP/05634/2020 y a través del Gobierno Regional de las Azores (M1.1.A/ REEQ.CIENTÍFICO UI&D/2021/010). Agradecemos a J. Pereira y S. Blasco su apoyo durante la recogida de muestras. GF fue financiado por la Fundación de Becas Académicas Alemanas (Studienstiftung des deutschen Volkes), y todo el trabajo de laboratorio relacionado con la secuenciación del gen 16S rRNA fue financiado por el Instituto de Ecología Evolutiva y Conservación de la Universidad de Ulm. CKP fue cofinanciado por el Programa Operativo AZORES 2020, a través del Fondo 01-0145-FEDER-000140 'Investigadores MarAZ: Consolidar un cuerpo de investigadores en Ciencias Marinas en las Azores' de la Unión Europea. YR fue financiado por una beca de doctorado del Fondo Regional de Ciencia y Tecnología, Gobierno de las Azores (M3.1.a/F/022/2020). JEB fue financiado por NSERC Vanier Canada Graduate Scholarship y un premio Weston Family Award en Northern Research. JFP y MLM recibieron el apoyo del Programa de Contaminantes del Norte (Relaciones Indígenas de la Corona y Asuntos del Norte de Canadá).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universität Ulm.

Instituto de Ecología Evolutiva y Genómica de la Conservación, Universidad de Ulm, Ulm, Alemania

Gloria Fackelmann y Simone Sommer

Instituto de Ciencias del Mar - Okeanos, Universidad de las Azores, Horta, Portugal

Christopher K. Pham y Yasmina Rodríguez

Biología, Universidad de Acadia, Wolfville, Nueva Escocia, Canadá

marca l mallory

División de Ecotoxicología y Salud de la Vida Silvestre, Medio Ambiente y Cambio Climático de Canadá, Ottawa, Ontario, Canadá

Jennifer F. Provencher

Departamento de Ciencias de los Recursos Naturales, Universidad McGill, Sainte-Anne-de-Bellevue, Quebec, Canadá

Julia E. Baak

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GF conceptualizó y diseñó el estudio, realizó el trabajo de laboratorio, analizó los datos y escribió el manuscrito bajo la supervisión de SSCKP aseguró la financiación y los permisos para la muestra de C. borealis. YR recolectó los datos asociados con C. borealis. MLM y JFP obtuvieron fondos y permisos para tomar muestras de F. glacialis. MLM, JFP y JEB recolectaron los datos asociados con F. glacialis. SS obtuvo fondos para todos los análisis de laboratorio relacionados con el microbioma dentro de su programa de Salud de la Vida Silvestre apoyado por la Universidad de Ulm. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Gloria Fackelmann o Simone Sommer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Ecology & Evolution agradece a Lauren Roman, Antton Alberdi y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Las pardelas cenicientas se recolectaron en el borde del giro subtropical del Atlántico norte en el archipiélago de las Azores (Portugal; punto verde oscuro; la distribución se muestra en verde) y los fulmares norteños se recolectaron cerca de Qikiqtarjuaq, Nunavut en el Atlántico noroccidental (punto púrpura oscuro; la distribución se muestra en púrpura).

Los filos dentro de cada muestra (n = 169 muestras obtenidas de 85 aves marinas individuales) se trazan por su abundancia relativa en el eje y. Los filos de baja abundancia (prevalencia < 0,1 y abundancia < 10) se agrupan y etiquetan como "Otros".

Cada punto representa una muestra de microbioma que está coloreada por la ubicación dentro del GIT, ya sea del microbioma proventricular (puntos azules, n = 85) o cloacal (puntos naranjas, n = 84). Métrica de diversidad alfa La métrica H de Allen se traza en relación con a la proporción de conteos de MP (conteo de MP/masa de ave individual) yb la proporción de masa de MP (masa de MP/masa de ave individual). Las líneas en cada gráfico denotan los valores predichos basados ​​en el modelo mixto lineal para la métrica de diversidad alfa y las áreas sombreadas que flanquean las líneas indican los intervalos de confianza del 95 % superior e inferior.

Gráficos de ordenación de análisis de coordenadas de principio (PCoA) con distancias UniFrac ponderadas a,b, distancias UniFrac no ponderadas c,d y gráficos de ordenación de análisis de componentes de principio (PCA) e,f con distancias euclidianas (enfoque de Aitchison). Cada punto representa una muestra de microbioma coloreada en una escala continua por (a,c,e) la proporción de recuento de MP (recuento de MP/masa de ave individual; n = 169) y (b,d,f) la proporción de masa de MP ( Masa de MP/masa de ave individual; n = 169) y las flechas magenta muestran la dirección de los efectos de MP.

Gráficos PCoA con distancias UniFrac ponderadas a,b, distancias UniFrac no ponderadas c,d y gráficos PCA e,f con distancias euclidianas (enfoque de Aitchison) ilustran los efectos de los conteos de MP en aves marinas proventriculares (a,c,e; n = 85) versus cloacal (b, d, f; n = 84) diversidad beta microbiana. Cada punto representa una muestra de microbioma coloreada en una escala continua por la proporción del recuento de MP (recuento de MP/masa de ave individual) y las flechas magenta muestran la dirección de los efectos de MP.

Gráficos PCoA con distancias UniFrac ponderadas a,b, distancias UniFrac no ponderadas c,d y e,f Gráficos PCA con distancias euclidianas (enfoque de Aitchison) ilustran los efectos del conteo de MP en la diversidad beta microbiana GIT en fulmares del norte (a,c,e ; n = 27) versus pardela cenicienta (b,d,f; n = 58). Cada punto representa una muestra de microbioma coloreada en una escala continua por la proporción del recuento de MP (recuento de MP/masa de ave individual) y las flechas magenta muestran la dirección de los efectos de MP.

Gráficos PCoA con distancias UniFrac ponderadas a,b, distancias UniFrac no ponderadas c,d y gráficos PCA e,f con distancias euclidianas (enfoque de Aitchison) ilustran los efectos de la masa MP en el proventricular de las aves marinas (a,c,e; n = 85) versus cloacal (b, d, f; n = 84) diversidad beta microbiana. Cada punto representa una muestra de microbioma coloreada en una escala continua por la proporción de masa de MP (masa de MP/masa de ave individual) y las flechas magenta muestran la dirección de los efectos de MP.

Gráficos PCoA con distancias UniFrac ponderadas a, b, distancias UniFrac no ponderadas c, d y e,f Gráficos PCA con distancias euclidianas (enfoque de Aitchison) ilustran los efectos de la masa MP en la diversidad beta microbiana GIT en fulmares del norte (a, c, e ; n = 27) versus pardela cenicienta (b,d,f; n = 58). Cada punto representa una muestra de microbioma coloreada en una escala continua por la proporción de masa de MP (masa de MP/masa de ave individual) y las flechas magenta muestran la dirección de los efectos de MP.

Resultados complementarios.

Leyendas para cada tabla incluida en cada hoja de cálculo de Excel.

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Fackelmann, G., Pham, CK, Rodríguez, Y. et al. Los niveles actuales de contaminación por microplásticos afectan los microbiomas intestinales de las aves marinas salvajes. Nat Ecol Evol 7, 698–706 (2023). https://doi.org/10.1038/s41559-023-02013-z

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Recibido: 21 Abril 2022

Aceptado: 14 febrero 2023

Publicado: 27 de marzo de 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41559-023-02013-z

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